稳定表达丙型肝炎病毒复合多表位基因p815细胞克隆的建立论文

《稳定表达丙型肝炎病毒复合多表位基因p815细胞克隆的建立论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、稳定表达丙型肝炎病毒复合多表位基因P815细胞克隆的建立论文韦三华，尹文，雷迎峰，胡兴斌，杨敬，吕欣，孙梦宁，徐志凯【关键词】丙型肝炎病毒EstablishmentofstablytransfectedP815celllineexpressingmultiepitopegeneofhepatitisCvirus【Abstract】AIM:ToconstructaeukaryoticexpressionvectorofHCVpoundmultiepitopegeneandobtainastablytransfectedP815cellline.METHODS:Th

2、ecDNAsequenceCtencodingtruncatedHCVcoregenelackingpartsofthecarboxylterminalregionplifiedbyPCRandinsertedintoshuttleplasmidpDE22.HCVmultiepitopegeneEmfromE2andnonstructualproteinsHⅠ/HindⅢandclonedintotheeukaryoticexpressingvectorpcDNA3.1(-)HⅠ/HindⅢandtherebinantplasmidpcDNA3.1(-)CtEm

3、eandscreenedbyG418andobtainedthestablytransfecedcellline.RESULTS:TheeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1(-)CtEmultiepitopegene,edbyRTPCR,IFAandIMedium1640培养基、异硫氰酸荧光素和辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG均购于华美公司.含有HCVH株全基因组序列的质粒（pBRTM/HCV1-3011）由美国华盛顿大学微生物学系RiceH教授惠赠.1.2方法1.2.1羧基端部分缺失的HCVC区基因扩增根据HCVH株C区基因序列

4、设计特异性引物.正向引物P1：5′GCCGGATCCATGAGCACGAATCCTAAACCT3′，引入BamHⅠ酶切位点；反向引物P2：5′GCAAGCTTTTAGCCATGCGCCAGGGCCCT3′，引入PstⅠ酶切位点.PCR模板为pBRTM/HCV1-3011,以引物P1,P2扩增HCV核心区氨基端144个氨基酸(432bp).PCR产物胶回收,记作Ct.1.2.2多表位基因的合成及连接参照文献［1］，选择E区的模拟表位和非结构蛋白区的优势表位，每个表位两端各保留3个氨基酸，各表位间用AAY分隔连接，以便于各表位保持独立性和能够有效呈递.5′和3′端分

5、别引入PstⅠ和HindⅢ酶切位点.全序列510bp分成6段S1~S6，序列间添加交叉互补序列，合成后用PCR方法退火连接，得到全长的多表位基因序列Ep，克隆入PGEMTeasy载体，计作TEp.1.2.3复合多表位基因与载体连接、转化及鉴定真核表达载体为pcDNA3.1(-)，先将PCR扩增得到的截短型C基因Ct用BamHⅠ/PstⅠ双酶切后，插入到大肠分枝杆菌穿梭质粒pDE22中的相应位点，构建pDE22Ct；再将多表位基因TEm用PstⅠ/HindⅢ双酶切后插入到pDE22Ct中的相应位点，构建成pDE22CtEm重组穿梭质粒，最后用BamHⅠ/HindⅢ

6、将CtEm切下，连接入用同样双酶切的真核表达载体pcDNA3.1(-)中，构建成重组真核表达载体pcDNA3.1(-)CtEm，不改变其编码区的框架结构.重组质粒pcDNA3.1CtEm的鉴定采用双位点单酶切鉴定，酶切鉴定得到的阳性克隆送TaKaRa公司进行核苷酸序列测定，用生物软件pcgene分析汇总结果.1.2.4细胞培养和G418工作浓度的筛选常规培养P815细胞于12孔板中，50mL/LCO2，37℃，培养基为RPMI1640(100mL/L胎牛血清,100mg/L青、链霉素,2mmol/L谷氨酰胺)，至细胞密度达80%布满时，加入含G418的培养液1m

7、L/孔（G418终浓度分别为100～800mg/L，8孔）.换液时保持G418浓度稳定不变，持续培养3～4g/L孔于第3日、500，400，300mg/L孔于第5日、200mg/L孔于第6日开始出现生长抑制现象，细胞开始溶解.20d后，G418浓度≤300mg/L的各孔细胞稳定生长，而≥400mg/L的细胞孔相继全部死亡.可以认为在本实验条件下G418的最佳工作浓度为300mg/L.1.2.5细胞转染与筛选稳定细胞克隆采用脂质体法转染,具体操作按LipofectAMINE2000说明书进行.转染48h后细胞用胰酶消化，细胞计数，按每孔40个细胞转移至96孔板.按

8、终浓度300mg/L加入