体内稳定表达her2多表位基因b16细胞系的建立

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1、体内稳定表达HER2多表位基因B16细胞系的建立作者：李贺,向泽敏,吴秀丽,王莉,卫红飞,万敏,王丽颖,于永利【摘要】　　目的:建立体内稳定表达HER2多表位基因的小鼠黑色素瘤B16细胞系。方法:利用分子克隆技术构建真核表达载体pcDNA3GFPHER2,阳离子脂质体介导法将其稳定转染入B16细胞,G418克隆筛选及体内传代后,流式细胞术(FCM)分选出GFPHER2表达阳性细胞群,对该群细胞进行无G418条件下的单克隆筛选并进行体内稳定性检测。结果:经限制性内切酶鉴定及序列分析,pcDNA3GFPHER2构建正确;最终建立的表达HER2基因B16细胞系体内传代

2、后GFPHER2阳性率高于90%。结论:成功建立了体内稳定表达HER2多表位基因的小鼠黑色素瘤细胞系,为其他体内稳定表达外源基因的转染细胞的建立提供了借鉴。【关键词】小鼠黑色素瘤细胞;HER2;阳离子脂质体　　［Abstract］AIM:ToestablishaB16celllinestablyexpressinggenesencodingHER2multiepitopepeptidesinvivo.METHODS:EukaryoticexpressingvectorpcDNA3GFPHER2wasconstructedbymolecularcloningtech

3、niqueandtransfected12intoB16cellsmediatedbycationicliposome.AfterscreenedwithG418,thetransfectedcellswerepassagedinvivo.TheGFPHER2positivecellswereisolatedfromtumorburdeningmicebyflowcytometry(FCM)sorting,andthenmonoclonizedintheabsenceofG418toobtainaB16celllinestablyexpressinggenesencod

4、ingHER2multiepitopepeptidesinvivo.Thiscelllinewasthenidentifiedafterbeingpassagedinvivo.RESULTS:RestrictionendonuleaseanalysisandDNAsequencingshowedthatthepcDNA3GFPHER2wasconstructedandaB16celllinestablyexpressinggenesencodingHER2multiepitopepeptidesinvivowasobtainedsuccessfully.TheGF

5、PHER2positiveproportionmaintainedhigherthan90%afterbeingpassagedinvivo.CONCLUSION:AB16celllinestablyexpressinggenesencodingHER2multiepitopepeptidesisestablishedsuccessfully,whichwouldprovideamethodtoestablishothercelllinesstablyexpressingexogenousgenes.　　［Keywords］B16cell;HER2;cationicl

6、iposome　　基因转染技术是生物学研究的重要手段［1,2］,目前用于基因转染的载体可分为病毒载体和非病毒载体两大类。阳离子脂质体转染法属于非病毒载体介导的基因转染方法,由于其具有操作方法简单、12可携带大片段DNA、试剂商品化和毒性低、安全和无免疫原性等优点,而逐渐替代病毒载体并为广大研究者所接受。但阳离子转染法转染的细胞在体内存在稳定性差的缺点［3,4］,这也一直是困扰大家的的难题。为了解决阳离子脂质体介导的基因转染细胞的体内稳定性问题,本研究以绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）为报告基因,将阳离子脂质体转染法及小鼠体内细胞传代、

7、流式细胞术(FCM)分选、无G418条件下的体外筛选等技术相结合,建立了小鼠体内稳定表达HER2多表位基因的小鼠黑色素瘤细胞系（B16）,该实验体系的建立为其他体内稳定表达外源基因的转染细胞的制备提供了很有价值的参考。　　1材料和方法　　1.1材料健康清洁级C57BL/6J小鼠(雌性,6～8周龄),购自北京维通利华实验动物技术有限公司。Lipofectin、TRIzol试剂购自Invitrogen公司。pMD18THER2载体（含HER2多表位基因)、pcDNA3GFP载体、C57BL/6J小鼠来源的黑色素瘤细胞株B16