乙肝多表位抗原基因非融合表达载体的构建和表达

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1、乙肝多表位抗原基因非融合表达载体的构建和表达【摘要】目的:研究乙型肝炎病毒（HBV）多表位基因的在原核载体中的克隆、游离表达及其产物的抗原性。方法:设计、并合成HBV多表位抗原基因BPT,克隆入原核表达载体pBAD/gIIIA,进而转化Top10大肠杆菌,阿拉伯糖诱导表达出HBV多表位抗原蛋白（BBPT）,并用Westernblot方法初步检测该抗原蛋白的抗原性。结果:成功构建了原核表达载体pBAD/BPT,在大肠杆菌中表达出HBV多表位抗原蛋白BBPT,Westernblot检测显示该蛋白具有良好抗原性。结论:HBV多表位抗原基因的设计是成功的,

2、其在大肠杆菌中表达的非融合蛋白具有良好的抗原性,可能是较理想的HBV治疗性疫苗候选物。【关键词】乙型肝炎病毒多表位治疗性疫苗　　乙肝是严重危害人类健康的疾病之一,但目前的乙肝治疗药物如IFNα和拉米夫定（lamivudine）疗效都不很理想。治疗性疫苗作为一种新的治疗途经,是乙肝治疗的理想方向之一。我们基于HBV表位的现有资料及前期工作,从HBV基因组中筛选出5个高度保守的HLA识别表位肽,串连拼接成乙型肝炎多表位抗原基因,并在大肠杆菌中得到克隆表达。　　1材料和方法12　　1.1材料质粒pBAD/gIIIA及大肠杆菌BL21、Top10由南方医科

3、大学分子生物学院保存。T4连接酶购自Promega公司,IPTG及T载体购自天象人生物工程公司,DNA标志物及限制性内切酶EcoRI、BamHI购自华美生物工程公司,HRP标记的羊抗鼠IgG购自武汉博士德生物工程公司。复合多表位抗原基因片段的选择见文献［1］。引物合成由上海生工生物工程公司合成,浓度2OD/管,工作浓度6μmol/L。　　1.2方法　　1.2.1HBV复合多价抗原基因的设计与合成参照文献［1］。　　1.2.2基因的克隆及阳性重组子的筛选根据pMD18T载体和pBAD载体的结构特征,设计两端带有NcoI和EcoRI酶切位点的引物:5′

4、GCCCATGGCAATGCAGTGGAACTCC3′（上游引入NcoI酶切位点）;5′GCGAATTCCACCCAGACGAGCTAC3′（下游引入EcoRI酶切位点）。以CAG176为模板［1］,PCR扩增出乙型肝炎预防治疗性疫苗基因BPT(扩增条件:94℃变性5min,94℃1min,55℃50s,72℃55s,扩增30个循环,最后72℃延长10min)。PCR扩增产物以冻融法割胶回收,与T载体15℃连接过夜后转入大肠杆菌DH5α,涂板培养,挑取单菌落培养,抽提质粒T/BPT,以NcoI和EcoRI酶切T/BPT及载体pBAD,冻融法回收

5、小片段和大片段,两者15℃连接过夜,12转化入大肠杆菌Top10,涂板培养。挑取单菌落抽提质粒,以NcoI和EcoRI双酶切,并以该质粒为模板,上述引物和PCR扩增条件进行扩增,酶切产物及扩增产物均以10g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定,以筛选出阳性重组子。　　1.2.3BPT原核表达载体的构建和表达筛选出的阳性重组克隆转化入大肠杆菌Top10,涂板培养,挑取单菌落在LB培养基中培养过夜后,按1％接种量接种到2mLLB培养基中,培养4h后加200G/L的阿拉伯糖至质量终浓度为0.2g/L诱导表达,3h后收菌,取菌液0.5mL,离心后去上清,沉淀中加入100μL

6、pH=8.0的TE和100μL2×SDS蛋白上样缓冲液,混匀后沸水中煮10min,取20μL上样,行150g/LSDSPAGE蛋白电泳。　　1.2.4蛋白的纯化使用SPSepharose阳离子柱层析纯化HiTrap,SPSepharoseHP5mL预装柱经20mmol/L、pH9.0的Tris.CL缓冲平衡液,将透析液上SP柱,用20mmol/L、缓冲液及含1mol/LNaCl的TrisHCl缓冲液（pH9.0）进行梯度洗脱并分步收集洗脱峰。　　1.2.5Westernblot检测融合蛋白与HBV患者血清反应的免疫特异性Westernblot方

7、法参照《分子克隆实验指南》第2版进行,一抗为BPT基因在原核融合表达蛋白P/BPT的小鼠免疫血清［2］,1∶1220稀释。二抗为辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗鼠IgG,1∶300稀释,DAB显色。　　2结果　　2.1pBAD/BPT重组表达质粒的构建以CAG176为摸板,按材料和方法所示引物及扩增条件行PCR扩增出BPT基因。扩增产物的20g/L琼脂糖凝胶电泳在400bp处可见扩增条带,如上述方法所述,该基因克隆入表达载体Pbad,行PCR鉴定可扩增出400bp片段（图1）,NcoI和EcoRI双酶切该质粒可切出400bp片段（图2）,与设计完全相符,

8、成功构建了重组质粒pBAD/BPT。　　图1重组质粒pBAD/BPT的PCR扩增图（略）　　F