口蹄疫病毒多抗原表位基因融合表达产物的抗原性分析

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1、口蹄疫病毒多抗原表位基因融合表达产物的抗原性分析：王冬梅,沈文涛,黎小瑛,周鹏【摘要】目的:筛选出高抗原性的口蹄疫病毒（FMDV）抗原表位组合体,为能有效启动细胞免疫、高广谱性的口蹄疫植物疫苗的研究提供研究基础。方法:通过化学方法合成O、A型口蹄疫病毒的5个T细胞表位基因和2个B细胞表位基因单链,采用套叠PCR的方法将T或是B细胞表位基因分别融合成融合体T或B,利用同尾酶的性质将融合体T和B连接成3种不同融合方式的串连体,即5′TBT3′、5′TTB3′和5′BTT3′;利用马铃薯X病毒(potatovirusX,PVX)载体在烟草叶片中表达各串连体基因、融合

2、体T基因、融合体B基因和O型口蹄疫病毒的VP1基因;RTPCR检测各基因在烟草(N.benthamiana)叶片中的转录水平;间接ELISA及D）是由口蹄疫病毒(footandmouthdiseasevirus,FMDV)引起一种偶蹄动物共患的急性、热性、高度接触性传染病,被国际兽医局列为头号A类传染病［1］。该病传播途径多、传播速度快,多血清型,曾多次在世界发生大流行,研制一种有效启动细胞免疫反应广谱抗病毒的疫苗是成功地防控FMD的先决条件。人们对FMDV抗原表位进行了广泛的研究,已经在VP1除外的其他结构和非结构蛋白上发现了某些确实能引起淋巴细胞扩增、加强体液免疫的肽段。我

3、们利用基因工程的手段表达这些表位基因来研制口蹄疫基因工程疫苗。在植物中表达抗原基因是一种安全、廉价的基因工程疫苗生产方式,目前已有较多成功的报道［2-4］。利用马铃薯X病毒载体在烟草叶片中表达抗原基因是一种快速、安全的表达系统,被广泛应用在利用稳定表达系统（核遗传的表达系统）之前检测研究设计的可行性分析及多种应用性的研究中［5,6］。本研究我们在合成已经确认的T或B细胞表位基因的基础上,将其进行融合和串连,利用马铃薯X病毒载体在烟草叶片中表达不同的串连体基因、FMDVVP1基因等,快速、准确地确定各表达产物的抗原性的免疫活性,为通过核遗传来稳定表达抗原基因、研制高效的植物疫苗提供可靠

4、的依据。1材料和方法1.1材料E．coliDH5α:常规克隆宿主菌,本实验室保存;pMD18TVector购于TaKaRa公司;马铃薯X病毒载体(PVX)PGR107(Kanr)及农杆菌GV3301＋PLICSa(辅助质粒,四环素抗性,Tetr)由英国Sainsbury实验室DavidBaulbe惠赠。A和O型口蹄疫全毒株的标准血清(抗小鼠)购自中国农业科学院兰州兽医所;山羊抗小鼠(IgGAP)及显色底物购自华美生物工程公司产品购自脱脂奶粉:完达山乳品有限公司产品,其他化学试剂均为国产分析纯。本生烟草(N.benthamiana)由中国热带农业科学院热带生物技术研究所刘志昕研究员

5、惠赠。1.2方法1.2.1各抗原表位基因单链及引物的合成(TaKaRa公司合成)1.2.1.1各表位基因单链合成采用豆科植物偏爱密码子合成A、O型口蹄疫结构蛋和非结构蛋白上的7个T、B细胞表位基因:（1）A型FMD3A蛋白上的21～35aa位氨基酸,AAIEFFEGMVHDSIK,T细胞表位,命名为T1;（2）A、O型FMD3C蛋白上保守的196～210aa位氨基酸,RSMLLKMKAHIDPEP,T细胞表位,命名为T2;（3）O型FMDVP2蛋白上的49～68aa位氨基酸,SGLETRVVQAERFFKTHCYD,T细胞表位,命名为T3;（4）O型FMDVP3蛋白上的81～100a

6、a位氨基酸,LAAKHMSNTFLAGLAQYYTQY,T细胞表位,命名为T4;（5）O型FMDVP4蛋白上的20～40aa位氨基酸,TQLGDNAISGGSNEGSTDTTS,T细胞表位,命名为T5;（6）A型FMDVP1蛋白上的138～160aa位氨基酸,TDGPRRGDMGSLTARAAKQLPAS,B细胞表位,命名为B1;（7）O型FMDVP1蛋白上的137～160aa位氨基酸,GESPVTNVRGDLQVLAQKAARTLP,B细胞表位,命名为B2。1.2.1.2各表位基因融合引物的设计与合成（1）所有T细胞表位基因融合引物设计:据套叠PCR技术在基因融合中的应用原理［7］

7、,设计10条基因片段融合引物（P1、P2…P10）及2条载体构建引物,为了各个表位基因在表达成肽段后不相互干扰,在引物P1P10上引入柔性氨基酸丝氨酸(Ser,TCC)/甘氨酸(Gly,GGA),或柔性氨基酸天冬氨酸(Asn,AAT)/甘氨酸(Gly,GGA)对应的核苷酸序列;P15、P16为载体构建引物,分别引入ClaⅠ、AvaⅢ和SalⅠ、PstⅠ酶切位点(AvaⅢ和PstⅠ为同尾酶)（2）2个B细胞表位基因融合引物设计:同理设计4条引物,P11、P