大肠杆菌表达人il-21融合蛋白的纯化和抗原性分析

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1、大肠杆菌表达人IL?21融合蛋白的纯化和抗原性分析：付强钱冬萌闫志勇侯伟王斌【摘要】目的在大肠杆菌中表达人IL?21编码基因，并进行蛋白纯化和抗原性分析。方法以经PHA刺激的人扁桃体细胞cDNA文库为模板，经PCR获得IL?21全基因片段。测序确认后，分别设计含BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的引物，经PCR获得IL?21成熟肽的编码基因。将此IL?21基因插入表达载体pGEX?4T?2，重组克隆经酶切与测序确认后转化大肠杆菌DH5α,进行IPTG诱导表达。经琼脂糖珠结合的纯化方法所得产物用etho

2、dsHumanIL?21genefragmentshumantonsilcDNAbyPCR.ThecodinggeneforthematureNterminusofIL?21edintoE.coliDH5α.TheexpressedproductatographyusingGSTFusionProteinPurificationbeadanditsantigenicityanalyzedby109、E.coliDH5α均为本室保存。PCR试剂、T4DNA连接酶、PCR产物纯化试剂盒、pGEM?T

3、EasyVector试剂盒均购自Promega公司。DNA限制性内切酶BamHⅠ、SalⅠ均购自Takara公司。引物均由北京赛百盛公司合成(PAGE纯化)，GSTFusionProteinPurificationbead购自Amersham公司。　　1.2IL?21全编码基因的克隆将经PHA刺激培养48h的人扁桃体细胞总RNA逆转录为cDNA后，进行PCR扩增。利用T4DNA连接酶将7.5μLPCR纯化产物与0.5μLT?Easy载体连接。同时，使用TSS法制备感受态大肠杆菌JM109，将连接

4、产物转化后在涂有X?Gal和IPTG的ALB固体培养基上培养,37℃放置12～16h。通过蓝白斑法选择阴性、阳性克隆，从中提取重组质粒DNA，采用PCR和酶切初步鉴定后，进行DNA序列测定分析。　　1.3IL?21重组表达质粒的构建利用含BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的引物，经PCR获得IL?21成熟肽的编码基因。经过纯化的PCR产物及载体pGEX4T?2同时用核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ消化后以T4连接酶连接，构建原核重组表达质粒。对用TSS法新鲜制备的感受态E.Coli.DH5α进行转化。对

5、转化长出的菌落进行质粒小提，用限制性内切酶进行初步鉴定后，进行DNA序列测定分析。　　1.4重组质粒在大肠杆菌中的诱导表达挑取单个重组成功菌落接种于5mLAmp?LB中,37℃震荡培养,当菌液吸光度达到0.4～0.6时,用终浓度为1mmol/L的IPTG诱导目的基因在大肠杆菌DH5菌中的表达。分别于诱导后1、2、4h取菌液3mL，12000r/min离心1min，沉淀用SDS凝胶加样缓冲液震荡后置沸水浴5min，稍微离心，上清移至新管,-20℃储存备用。同时，用DH5α宿主菌和未诱导的含重组质粒

6、的DH5α菌，以及诱导的含pGEX4T?2质粒的DH5α菌样品作对照行SDS?PAGE。　　1.5表达蛋白的纯化和arker。然后，参照分子克隆实验操作。一抗为IL?2的单克隆抗体，二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG。　　2结果　　2.1目的基因的PCR扩增PCR扩增的IL?21全编码基因长为642bp，其中成熟N端编码基因长为396bp。同DNA标准相对分子质量参照物相比，PCR扩增产物的大小与预测的结果一致（图1）。　　2.2原核重组表达质粒的鉴定经PCR扩增出的IL?21成熟肽的编码基

7、因片段和鉴定重组成功的质粒经双酶切后同时进行电泳，可见酶切产物和PCR扩增条带大小与理论值相符（图2）。　　2.3表达蛋白的SDS?PAGE经SDS?PAGE，考马斯亮蓝R?250染色观察，含重组质粒的诱导菌在相对分子质量为41000位置出现一蛋白条带，而未诱导的重组质粒转化菌在相应位置没有蛋白条带；含质粒pGEX4T?2的诱导菌在相对分子质量为26000位置出现一条带。目的基因表达的多肽相对分子质量估计为15000，与融合蛋白共同表达相对分子质量约为41000的多肽，与理论估计相一致。经凝胶成

8、像扫描，融合蛋白产量占总蛋白的10%（图3）。　　2.4表达蛋白的纯化大体积蛋白表达后，将细菌裂解液上清和纯化浓缩的蛋白进行电泳分析，结果显示得到理想的纯化融合蛋白条带(图4)。　　2.5表达蛋白的WesternBlotting检测鉴定将纯化的融合蛋白进行SDS?PAGE，电泳后作WesternBlotting分析，结果可见有与理论相符的条带（图5）。　　3讨论人IL?21是IL?2家族中的新成员，主要由活化的CD+4T细胞产生，与IL?2、IL?15、IL?4等细胞因子具有高度同源性。其基因定