大肠杆菌表达人il21融合蛋白的纯化和抗原性分析_论文

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1、大肠杆菌表达人IL21融合蛋白的纯化和抗原性分析作者：付强钱冬萌闫志勇侯伟王斌【摘要】目的在大肠杆菌中表达人IL21编码基因，并进行蛋白纯化和抗原性分析。方法以经PHA刺激的人扁桃体细胞cDNA文库为模板，经PCR获得IL21全基因片段。测序确认后，分别设计含BamHⅠ和SalⅠ酶切位点的引物，经PCR获得IL21成熟肽的编码基因。将此IL21基因插入表达载体pGEX4T2，重组克隆经酶切与测序确认后转化大肠杆菌DH5α,进行IPTG诱导表达。经琼脂糖珠结合的纯化方法所得产物用WesternBlotting作抗原性分析。结果

2、SDSPAGE显示经IPTG诱导后的大肠杆菌DH5α表达与理论相符的条带，并获得了与理论值相符的纯化条带，在进一步的WesternBlotting分析中发现表达的蛋白能与IL2的单抗产生结合反应。结论人IL21编码基因克隆载体在大肠杆菌中成功表达，同时建立了该蛋白的琼脂糖珠纯化方法，通过免疫印迹实验揭示了原核表达的IL21蛋白与IL2之间结构的相似性。【关键词】白细胞介素21;基因表达;免疫印迹法；重组融合蛋白质类［ABSTRACT］ObjectiveToexpresscodinggeneof8/8humaninterleuki

3、n21(IL21)in,purifyitsprotein,andassayitsIL21genefragmentswereobtainedfromhumantonsilcDNAbyPCR.ThecodinggeneforthematureNterminusofIL21wasinsertedintoprokaryoticexpressingvectorpGEX4T2andtransformedintoDH5α.TheexpressedproductwaspurifiedbyaffinitychromatographyusingG

4、STFusionProteinPurificationbeadanditsantigenicityanalyzedbyWesternbyIPTG,DH5αexpressedtherightmolecularweightprotein.WesternBlottingtestshowedtheproteinhadreactionwithIL2monoclonalvectorpGEX4T2/IL21andengineeringbacteriaDH5αexpressingIL21matureNterminusfusionproteini

5、ssuccessfullyconstructed.BypurificationandWesternBlottingtest,therecombinantIL21revealedresemblantantigenicitytoIL2.［KEYWORDS］Interleukin21;Geneexpression;Immunoblotting;Recombinantfusionproteins8/8以美国JULIA教授为首的研究小组在国际上首次构建了BaF3/IL21R细胞系，并用此细胞系从活化的CD+3细胞中分离并鉴定了一类新的细胞因

6、子——人白细胞介素21（IL21）[1]，此后世界范围多个实验室相继进行了相关研究。现在已知IL21具有广泛的生物学功能，能够调节体液和细胞介导的免疫应答，刺激T、B和NK细胞的增殖、活化和分化，并且对肿瘤细胞的生长有抑制作用[2～4]。本研究构建了中国人IL21基因编码的重组质粒，并在大肠杆菌中进行表达[5]。同时通过进一步对表达产物进行GST亲和层析纯化后，使用IL2单克隆抗体与重组蛋白做WesternBlotting抗原性分析。现将结果报告如下。1材料和方法质粒、菌株和主要试剂质粒pGEX4T2和菌株JM109、DH5α均

7、为本室保存。PCR试剂、T4DNA连接酶、PCR产物纯化试剂盒、pGEMTEasyVector试剂盒均购自Promega公司。DNA限制性内切酶BamHⅠ、SalⅠ均购自Takara公司。引物均由北京赛百盛公司合成(PAGE纯化)，GSTFusionProteinPurificationbead购自Amersham公司。IL21全编码基因的克隆将经PHA刺激培养48h的人扁桃体细胞总RNA逆转录为cDNA后，进行PCR扩增。利用T4DNA连接酶将μLPCR纯化产物与μLTEasy载体连接。同时，使用TSS法制备感受态大肠杆菌JM10

8、9，将连接产物转化后在涂有XGal和IPTG的ALB固体培养基上培养,37℃放置12～16h。8/8通过蓝白斑法选择阴性、阳性克隆，从中提取重组质粒DNA，采用PCR和酶切初步鉴定后，进行D