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时间:2018-07-17
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1、牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化(一)的论文论文关键词:牙龈卟啉单胞菌 菌毛 大肠杆菌表达系统 融合蛋白 固定化金属螯合亲和层析 论文摘要:研究背景:慢性牙周炎在我国有很高的发病率,严重影响国民健康水平。慢性牙周炎不仅是导致成人牙齿功能丧失的主要原因之一,而且还可能是某些系统性疾病的危险因素。慢性牙周炎是一种细菌感染性疾病,牙龈卟啉单胞菌(porphyromonasgingivalis,pg)是其主要可疑致病菌。菌毛(fimbriae)是pg的重要致病因子,可介导pg附着于口腔内各种组织细胞的表面,以有利于pg在体内进一步的粘附和侵袭;可引发炎
2、症反应和免疫反应。并且菌毛具有良好的免疫原性,可诱导机体的保护性免疫应答。目前,慢性牙周炎的治疗效果还不理想,因此探索预防慢性牙周炎的有效途径具有重要意义。 研究目的:本研究拟在大肠杆菌中表达fima蛋白并进行蛋白纯化。为后续实验制备抗fima蛋白的多克隆抗体提供实验基础。 研究方法:1.以大肠杆菌bl21(de3)plyss为宿主菌,用iptg诱导fima表达,通过sds-page和mol/l,诱导时间为3h时蛋白表达量最大;当iptg浓度为1mmol/l,诱导时间为1h时蛋白表达量最小。a表达产物经sds-page后,转移至硝酸纤维素膜,x线片感光,在x线片上相应位置
3、呈现阳性结果,可见一明显蛋白条带,而空质粒pet-15b对应位置未见特异条带。蛋白表达形式分析结果表明表达的融合蛋白位于包涵体中。2.表达产物经co2+柱亲和层析,sds-page上出现一致的单一条带,其分子量大小与预期相符(约41kda)。6×his-fima纯化产物经sds-page后,转移至硝酸纤维素膜,x线片感光,在x线片上相应位置呈现阳性结果,可见一明显蛋白条带,条带位置与bl21(de3)plyss全菌诱导表达后相应蛋白位置一致。经bca法蛋白浓度定量试剂盒对纯化后的蛋白质进行定量分析,计算出纯化后的fima蛋白浓度为0.96mg/ml。 主要结论:用本课题组前
4、期构建的fima基因的原核表达质粒pet-15b-fima,在大肠杆菌bl21(de3)plyss中诱导表达后,fima基因能够得到正确表达。表达产物经co2+柱亲和层析,可以得到带6×his标签的fima融合蛋白。 1绪论 慢性牙周炎是导致成人牙齿功能丧失的主要原因之一,在我国有很高的发病率,严重影响国民健康水平。牙周炎造成的牙周组织的破坏是持续性的,一旦发生,目前的治疗手段还不能使牙周组织达到完全的恢复。牙周炎还可能是某些系统性疾病的危险因素。随着我国经济的发展、人民生活水平的提高和人群寿命的延长,对牙周健康状况的关注日益提高。因此,探索预防慢性牙周炎的有效途径对于提
5、高国民健康水平具有重要意义。 疫苗在人和家畜疾病防治方面具有极大的作用,是一种有效的防治疾病的手段。从减毒活疫苗、死疫苗、亚单位疫苗、重组疫苗到dna疫苗,由于技术不断改进,使得疫苗有了广泛的应用,被成功的用于许多细菌或病毒感染的防治,因此以疫苗来防治牙周炎也已成为一个重要思路。 慢性牙周炎是一种细菌感染性疾病,牙龈卟啉单胞菌(porphyromonasgingivalis,pg)是其主要可疑致病菌[1]。菌毛是pg表面主要毒力因子之一,菌毛蛋白(fimbrillin,fima)是其主要亚单位,能够介导pg对宿主组织的粘附与入侵,以及与口内其他细菌的粘附共聚[1-3],还
6、能刺激炎性因子的产生[4]。多菌毛pg野生型菌株可引起定菌大鼠牙槽骨吸收,而无菌毛的突变菌株则不会造成牙槽骨的破坏。也有实验发现,用fima免疫大鼠可减轻由pg引起的牙槽骨破坏[5],将抗fima的单克隆抗体用于口腔被动免疫,可以抑制该菌在口腔的定植[6]。因此,可以将fima作为防治牙周炎疫苗抗原。 pg菌毛的单体是fima,由单拷贝fima基因编码。fima基因全长1290bp,开放读框包括1044bp,编码347个氨基酸。翻译后产物菌毛蛋白的功能域(如刺激t细胞和b细胞的位点、刺激细胞因子产生的位点等)位于氨基酸序列的31~331aa不等,各个位点之间可相互交叉或覆盖
7、。近年来由于分子生物学和免疫学的发展,fima基因已被克隆和测序,对蛋白质分子中的各个功能区、抗原表位已有了更深入的了解,为研制疫苗提供了可靠的依据。 根据国内外研究进展,在前期已构建fima原核表达质粒的基础上,本研究拟在大肠杆菌bl21(de3)plyss中表达fima融合蛋白,并通过金属螯合亲和层析技术进行纯化,为后续实验制备抗fima蛋白的多克隆抗体、研发用于人类的、可有效防治牙周炎的dna疫苗提供实验基础。 2文献回顾 牙周炎是口腔疾病中的常见病和多发病,在我国有很高的发病率[7]。牙周
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