牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fima基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化（一）的论文

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1、牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化（一）的论文论文关键词：牙龈卟啉单胞菌　菌毛　大肠杆菌表达系统　融合蛋白　固定化金属螯合亲和层析　　论文摘要：研究背景：慢性牙周炎在我国有很高的发病率，严重影响国民健康水平。慢性牙周炎不仅是导致成人牙齿功能丧失的主要原因之一，而且还可能是某些系统性疾病的危险因素。慢性牙周炎是一种细菌感染性疾病，牙龈卟啉单胞菌（porphyromonasgingivalis,pg）是其主要可疑致病菌。菌毛（fimbriae）是pg的重要致病因子，可介导pg附着于口腔内各种组织细胞的表面，以有利于pg在体内进一步的粘附和侵袭；可引发炎

2、症反应和免疫反应。并且菌毛具有良好的免疫原性，可诱导机体的保护性免疫应答。目前，慢性牙周炎的治疗效果还不理想，因此探索预防慢性牙周炎的有效途径具有重要意义。　　研究目的：本研究拟在大肠杆菌中表达fima蛋白并进行蛋白纯化。为后续实验制备抗fima蛋白的多克隆抗体提供实验基础。　　研究方法：1.以大肠杆菌bl21(de3)plyss为宿主菌，用iptg诱导fima表达，通过sds-page和mol/l，诱导时间为3h时蛋白表达量最大；当iptg浓度为1mmol/l，诱导时间为1h时蛋白表达量最小。a表达产物经sds-page后，转移至硝酸纤维素膜，x线片感光，在x线片上相应位置

3、呈现阳性结果，可见一明显蛋白条带，而空质粒pet-15b对应位置未见特异条带。蛋白表达形式分析结果表明表达的融合蛋白位于包涵体中。2.表达产物经co2+柱亲和层析，sds-page上出现一致的单一条带，其分子量大小与预期相符（约41kda）。6×his-fima纯化产物经sds-page后，转移至硝酸纤维素膜，x线片感光，在x线片上相应位置呈现阳性结果，可见一明显蛋白条带，条带位置与bl21(de3)plyss全菌诱导表达后相应蛋白位置一致。经bca法蛋白浓度定量试剂盒对纯化后的蛋白质进行定量分析，计算出纯化后的fima蛋白浓度为0.96mg/ml。　　主要结论：用本课题组前

4、期构建的fima基因的原核表达质粒pet-15b-fima，在大肠杆菌bl21(de3)plyss中诱导表达后，fima基因能够得到正确表达。表达产物经co2+柱亲和层析，可以得到带6×his标签的fima融合蛋白。　　1绪论　　慢性牙周炎是导致成人牙齿功能丧失的主要原因之一，在我国有很高的发病率，严重影响国民健康水平。牙周炎造成的牙周组织的破坏是持续性的，一旦发生，目前的治疗手段还不能使牙周组织达到完全的恢复。牙周炎还可能是某些系统性疾病的危险因素。随着我国经济的发展、人民生活水平的提高和人群寿命的延长，对牙周健康状况的关注日益提高。因此，探索预防慢性牙周炎的有效途径对于提

5、高国民健康水平具有重要意义。　　疫苗在人和家畜疾病防治方面具有极大的作用，是一种有效的防治疾病的手段。从减毒活疫苗、死疫苗、亚单位疫苗、重组疫苗到dna疫苗，由于技术不断改进，使得疫苗有了广泛的应用，被成功的用于许多细菌或病毒感染的防治，因此以疫苗来防治牙周炎也已成为一个重要思路。　　慢性牙周炎是一种细菌感染性疾病，牙龈卟啉单胞菌(porphyromonasgingivalis,pg)是其主要可疑致病菌[1]。菌毛是pg表面主要毒力因子之一，菌毛蛋白(fimbrillin，fima)是其主要亚单位，能够介导pg对宿主组织的粘附与入侵，以及与口内其他细菌的粘附共聚[1-3]，还

6、能刺激炎性因子的产生[4]。多菌毛pg野生型菌株可引起定菌大鼠牙槽骨吸收，而无菌毛的突变菌株则不会造成牙槽骨的破坏。也有实验发现，用fima免疫大鼠可减轻由pg引起的牙槽骨破坏[5]，将抗fima的单克隆抗体用于口腔被动免疫，可以抑制该菌在口腔的定植[6]。因此，可以将fima作为防治牙周炎疫苗抗原。　　pg菌毛的单体是fima，由单拷贝fima基因编码。fima基因全长1290bp，开放读框包括1044bp，编码347个氨基酸。翻译后产物菌毛蛋白的功能域（如刺激t细胞和b细胞的位点、刺激细胞因子产生的位点等）位于氨基酸序列的31～331aa不等，各个位点之间可相互交叉或覆盖

7、。近年来由于分子生物学和免疫学的发展，fima基因已被克隆和测序，对蛋白质分子中的各个功能区、抗原表位已有了更深入的了解，为研制疫苗提供了可靠的依据。　　根据国内外研究进展，在前期已构建fima原核表达质粒的基础上，本研究拟在大肠杆菌bl21（de3）plyss中表达fima融合蛋白，并通过金属螯合亲和层析技术进行纯化，为后续实验制备抗fima蛋白的多克隆抗体、研发用于人类的、可有效防治牙周炎的dna疫苗提供实验基础。　　2文献回顾　　牙周炎是口腔疾病中的常见病和多发病，在我国有很高的发病率[7]。牙周