牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fima基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化（三）论文

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1、牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化（三）论文本实验表达的His-FimA融合蛋白主要用于后续实验获得免疫血清和多克隆抗体，因此需求量较大，而且不用考虑靶蛋白是否具有活性。本实验所表达的His-FimA融合蛋白主要位于包涵体中，这种以包涵体形式表达的蛋白很稳定，不易被降解。这样在下一步实验纯化FimA蛋白时，可以在变性条件（使用变性剂8M尿素或者6M的胍盐酸）下溶解包涵体，以便于使用Co2+柱亲和层析得到纯化的靶蛋白。本实验所使用的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS所带pLysS具有氯霉素抗性。在将重组质粒和

2、空质粒转化入宿主菌时，不需要使用IPTG进行蓝白筛选.freelA基因的原核表达质粒pET-15b-fimA，在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达后，fimA基因得到正确表达。4实验二FimA蛋白的纯化与鉴定4.1实验材料与仪器4.1.1菌珠携带有pET-15bVector和pET-15b-fimA的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS：实验一获得。4.1.2主要试剂1）BCA法蛋白定量试剂盒：碧云天公司2）TALON纯化试剂盒：ClontechLaboratories,Inc,USA3）其他：同实验一4.1.3实验仪器1）

3、宝特ELX-800酶标仪：宝特仪器有限公司2）其他：同实验一4.2实验方法4.2.1样品制备按照TALON纯化试剂盒操作说明书制备样品，步骤如下：1）在转化了质粒pET-15b-fimA的LB固体培养基上，用接种环挑取阳性克隆菌落，接种于5mlAmp+(100μg/ml)的LB培养液中，37℃振摇过夜。2）将5ml过夜菌转接于500mlLB(Amp+)培养液中，37℃振摇4h；加入IPTG致终浓度为2mmol/L，37℃振摇3h。3）4℃，5500r/min离心20min收集细菌沉淀，弃上清，沉淀置于冰上或－20℃保存。4）用Buffe

4、rA（pH7.0）重悬细胞沉淀物，每25ml细胞培养物使用2ml缓冲液。5）轻轻振荡样品直到它变得半透明为止。6）4℃，10000～12000r/min离心20min以去除不溶性杂质。7）小心的转移上清液到一个干净的离心管，不要触动沉淀物。离心管中的澄清的上清液就是样品了。4.2.2分批/重力流柱子纯化FimA蛋白按照TALON纯化试剂盒操作说明书进行，步骤如下：1）彻底重悬TALON树脂。2）快速转移3ml树脂悬液入一个无菌的离心管，700g离心2min，弃上清。3）加入10倍柱床体积的BufferA（pH7.0），小心混匀以平衡树脂

5、，700g离心2min，弃上清。4）重复步骤3。5）加入4.2.1所制备的样品。6）室温下，小心搅拌上一步所得混合液20min，700g离心5min。7）小心移除尽可能多的上清液，注意不要触碰到沉淀在离心管底的树脂。8）用10～20柱床体积的BufferA（pH7.0）冲洗树脂。室温下，小心搅拌悬液10min，以达到更彻底的冲洗效果，700g离心5min，弃上清。9）重复步骤8。10）加入1倍柱床体积的BufferA（pH7.0），重悬混合。11）转移树脂到一个2ml的重力流层析柱中，缓冲液从层析柱底部引流出来直至到达柱床顶部，该过程中

6、要确保树脂柱床中不能有气泡进入。12）用五倍柱床体积的加入了8mM的咪唑的BufferA（pH7.0）冲洗柱子。13）加入5倍柱床体积的BufferB洗脱，按每500μl一份来收集洗脱产物。14）用SDS-PAGE的分析结果来确定哪一份洗脱产物中含有目的蛋白。15）将含有纯化蛋白的洗脱液以BufferC稀释后，置于透析袋中，在4℃搅拌条件下，梯度透析：4M尿素→2M尿素→1×PBS＋1MNaCL→l×PBS+0.5MNaCL→1×PBS→0.5×PBS→ddH2016）将透析好的蛋白质留出20μl用于蛋白含量测定，其余蛋白质冻干后做好标

7、记置于－70℃保存。BufferA（pH7.0）：50mMNa3PO4,,nbsp;8MUrea(尿素)300mMNaClBufferB（pH7.0）：45mMNa3PO47.2MUrea(尿素)270mMNaCl150mM咪唑BufferC（pH7.0）：100mMNaH2PO410mMTris-Cl8MUrea(尿素)4.2.3FimA蛋白含量测定按照BCA法蛋白定量试剂盒操作说明书操作，步骤如下：1）使用时将SolutionA摇晃混匀，根据样品数量，按50体积SolutionA加1体积SolutionB（50:1）配制适量BCA工

8、作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。2）完全溶解蛋白标准品(5mg/mlBSA)，取40μl，用PBS稀释至200μl，使终浓度为1mg/ml。3）将稀释后的蛋白标准品(1mg/mlBSA)按0