牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化二

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1、牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化（二）　　5）金属螯合亲和层析用于蛋白质的复性　　在基因工程技术中，表达的重组蛋白多以包涵体形式存在，蛋白质经常会错误折叠而丧失活性，这一难题长久以来都没有得到很好的解决。高浓度的变性剂可以溶解包涵体，然后控制变性剂除去的速度，有时需要添加适当的氧化/还原试剂，蛋白质可以逐步折叠复性。通常使用的复性方法有三种，分别是稀释复性、透析复性和层析复性。　　（1）稀释复性：直接把溶解的蛋白质稀释于复性缓冲液中。这种方法操作简单，适于小规模使用，但只适于浓度极低的蛋白质复性，否则会有大量聚集体形成。　　（2）透析复性：采用透析膜通过

2、逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度。这种方法速度慢、耗时长，不适合大规模使用，有时易形成无活性蛋白聚集体。30　　（3）层析复性：使蛋白质可逆吸附在固相介质上，例如离子交换层析介质、金属螯合亲和层析介质等，可以避免伸展的多肽分子之间形成聚集体。金属螯合亲和层析(IMAC)是一种有效的纯化和复性蛋白质的层析方法。在高浓度变性剂存在的情况下，组氨酸尾仍旧具有吸附在金属螯合亲和层析介质上的能力，所以可在IMAC介质上同时实现复性与纯化[112-116]。蛋白质吸附在IMAC介质后，先逐步降低变性剂的浓度，使蛋白质折叠，然后提高咪唑浓度把折叠后的蛋白质洗脱出来。对于TNF蛋白，使用IMA

3、C获得了90%的复性收率[73]。　　2.6小结　　大肠杆菌系统由于其遗传学、生物化学和分子生物学方面已充分被人们了解而成为表达许多异源蛋白质的首选表达系统。在过去的20多年中，用各种载体系统在大肠杆菌中表达了数百种重组蛋白。融合标签不但可提高重组蛋白的产量，还可增强重组蛋白质的可溶性。融合标签技术的发展使重组蛋白质的纯化更加快速、简便。随着金属螯合亲和层析技术的不断发展和改进，目前，固定化金属螯合亲和层析技术已成为蛋白质，特别是基因重组蛋白和多肽分离纯化最有效的工具之一。　　本课题组已成功构建了Pg菌毛蛋白fimA基因的原核表达质粒pET-15b-fimA，本研究在此基础上，拟将此

4、质粒在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中表达，然后用固定化金属螯合亲和层析技术得到纯化的FimA蛋白，为下一步获取免疫血清、进一步研制具有实用价值的预防牙周炎的免疫疫苗提供实验基础。30　　3实验一fimA在大肠杆菌中的表达　　3.1实验材料与仪器　　3.1.1菌珠　　1）大肠杆菌BL21(DE3)pLysS：北京天根生化科技有限公司。该菌株基因型为：F-，ompT，hsdSB(rB-mB-)，dcm(DE3)，gal，pLysS，Camr，该菌珠所带pLysS具有氯霉素抗性。此质粒含有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。适于

5、毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。　　2）携带有pET-15bVector和pET-15b-fimA的大肠杆菌TOP10（本课题组前期实验获得）。其中pET-15bVector：原核表达载体，双链环状DNA，由5708bp组成，含有可插入外源基因的多克隆位点（MCS）、Amp抗性基因、T7lac、T7promoter、lacoperator、T7terminator、N-末端His-Tag（6个组氨酸）。是一种组氨酸融合表达载体，这6个组氨酸标签便于用钴柱纯化或以抗组氨酸抗体筛选。pET-15b载体读框及多克隆位点见图3.1，其克隆、表达区见图3.2。30　　　　　　　　　　　　图3.1原

6、核表达载体质粒pET-15b图谱　　　　　　　　　　　图3.2pET-15b载体克隆、表达区　　3.1.2主要试剂　　1）DNAMarkerVI：北京天为时代科技有限公司　　2）预染蛋白质MarkerⅢ：北京天根生化科技有限公司　　3）细菌LB培养基（胰蛋白胨、酵母提取物）：Promega公司　　4）琼脂糖（Agarose）：上海生工生物技术有限公司　　5）琼脂粉（Agarpowder）：上海化学试剂公司　　6）脱氧胆酸钠：上海亚培生物科技有限公司　　7）丙烯酰胺、双丙烯酰胺、四甲基二乙胺（TEMED）、十二烷基磺酸钠(SDS)、二硫苏糖醇（DTT）、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（I

7、PTG）、Tris碱、甘氨酸、溴酚蓝：AmrescoUSA30　　8）考马斯亮蓝（BrilliantBlueR-250）：上海绿岛科技发展有限公司分装　　9）ECL底物化学发光试剂盒：PierceBiotechnologyUSA　　10）质粒小提试剂盒：北京天为时代科技有限公司　　11）硝酸纤维素膜（NC膜）：浙江省台州市四甲生化厂　　12）一抗（Anti-hisantibody，小鼠单克隆抗体IgG2b）：北京天根生化科技有限公司　　13）二抗（Goat