欢迎来到天天文库
浏览记录
ID:21012389
大小:69.00 KB
页数:8页
时间:2018-10-18
《牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fima基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化(三)》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化(三) 本实验表达的His-FimA融合蛋白主要用于后续实验获得免疫血清和多克隆抗体,因此需求量较大,而且不用考虑靶蛋白是否具有活性。本实验所表达的His-FimA融合蛋白主要位于包涵体中,这种以包涵体形式表达的蛋白很稳定,不易被降解。这样在下一步实验纯化FimA蛋白时,可以在变性条件(使用变性剂8M尿素或者6M的胍盐酸)下溶解包涵体,以便于使用Co2+柱亲和层析得到纯化的靶蛋白。 本实验所使用的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS所带pLysS具有氯霉素抗性。在将重组质粒和空质粒转化入宿主菌时,不需要使
2、用IPTG进行蓝白筛选,因为pET-15bVector含有氨苄青霉素抗性基因,转化了重组质粒和空质粒的BL21(DE3)pLysS同时具有氯霉素和氨苄青霉素抗性,而未转化的菌珠只有氯霉素抗性,这样就可以使用氨苄青霉素来对转化菌进行筛选。 本实验用本课题组前期构建的fimA基因的原核表达质粒pET-15b-fimA,在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中诱导表达后,fimA基因得到正确表达。 4实验二FimA蛋白的纯化与鉴定 4.1实验材料与仪器 4.1.1菌珠 携带有pET-15bVector和pET-15b-fimA的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS:
3、实验一获得。 4.1.2主要试剂 1)BCA法蛋白定量试剂盒:碧云天公司 2)TALON纯化试剂盒:ClontechLaboratories,Inc,USA 3)其他:同实验一 4.1.3实验仪器 1)宝特ELX-800酶标仪:宝特仪器有限公司 2)其他:同实验一 4.2实验方法4.2.1样品制备 按照TALON纯化试剂盒操作说明书制备样品,步骤如下: 1)在转化了质粒pET-15b-fimA的LB固体培养基上,用接种环挑取阳性克隆菌落,接种于5mlAmp+(100μg/ml)的LB培养液中,37℃振摇过夜。 2)将5ml过夜菌转接于500mlLB
4、(Amp+)培养液中,37℃振摇4h;加入IPTG致终浓度为2mmol/L,37℃振摇3h。 3)4℃,5500r/min离心20min收集细菌沉淀,弃上清,沉淀置于冰上或-20℃保存。 4)用BufferA(pH7.0)重悬细胞沉淀物,每25ml细胞培养物使用2ml缓冲液。 5)轻轻振荡样品直到它变得半透明为止。 6)4℃,10000~12000r/min离心20min以去除不溶性杂质。 7)小心的转移上清液到一个干净的离心管,不要触动沉淀物。离心管中的澄清的上清液就是样品了。 4.2.2分批/重力流柱子纯化FimA蛋白 按照TALON纯化试剂盒操作说明
5、书进行,步骤如下: 1)彻底重悬TALON树脂。 2)快速转移3ml树脂悬液入一个无菌的离心管,700g离心2min,弃上清。 3)加入10倍柱床体积的BufferA(pH7.0),小心混匀以平衡树脂,700g离心2min,弃上清。 4)重复步骤3。 5)加入4.2.1所制备的样品。 6)室温下,小心搅拌上一步所得混合液20min,700g离心5min。 7)小心移除尽可能多的上清液,注意不要触碰到沉淀在离心管底的树脂。 8)用10~20柱床体积的BufferA(pH7.0)冲洗树脂。室温下,小心搅拌悬液10min,以达到更彻底的冲洗效果,700g离心5
6、min,弃上清。 9)重复步骤8。 10)加入1倍柱床体积的BufferA(pH7.0),重悬混合。 11)转移树脂到一个2ml的重力流层析柱中,缓冲液从层析柱底部引流出来直至到达柱床顶部,该过程中要确保树脂柱床中不能有气泡进入。 12)用五倍柱床体积的加入了8mM的咪唑的BufferA(pH7.0)冲洗柱子。 13)加入5倍柱床体积的BufferB洗脱,按每500μl一份来收集洗脱产物。 14)用SDS-PAGE的分析结果来确定哪一份洗脱产物中含有目的蛋白。 15)将含有纯化蛋白的洗脱液以BufferC稀释后,置于透析袋中,在4℃搅拌条件下,梯度透析:
7、 4M尿素→2M尿素→1×PBS+1MNaCL→l×PBS+0.5MNaCL →1×PBS→0.5×PBS→ddH20 16)将透析好的蛋白质留出20μl用于蛋白含量测定,其余蛋白质冻干后做好标记置于-70℃保存。 BufferA(pH7.0):50mMNa3PO4,,nbsp;8MUrea(尿素)300mMNaCl BufferB(pH7.0):45mMNa3PO47.2MUrea(尿素)270mMNaCl150mM咪唑 BufferC(pH7.0): 100mMNaH2PO410mMTris-Cl 8MUrea(
此文档下载收益归作者所有