牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fima基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化（

《牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fima基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化（》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、牙龈卟啉单胞菌菌毛蛋白fimA基因在大肠杆菌中的融合表达和纯化（论文关键词：牙龈卟啉单胞菌　菌毛　大肠杆菌表达系统　融合蛋白　固定化金属螯合亲和层析　　论文摘要：研究背景：慢性牙周炎在我国有很高的发病率，严重影响国民健康水平。慢性牙周炎不仅是导致成人牙齿功能丧失的主要原因之一，而且还可能是某些系统性疾病的危险因素。慢性牙周炎是一种细菌感染性疾病，牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonasgingivalis,Pg）是其主要可疑致病菌。菌毛（fimbriae）是Pg的重要致病因子，可介导Pg附着于口腔内各种组织细胞的表面，以有利于Pg在体内进一步的粘附和侵袭；可引发炎症反应

2、和免疫反应。并且菌毛具有良好的免疫原性，可诱导机体的保护性免疫应答。目前，慢性牙周炎的治疗效果还不理想，因此探索预防慢性牙周炎的有效途径具有重要意义。　　研究目的：本研究拟在大肠杆菌中表达FimA蛋白并进行蛋白纯化。为后续实验制备抗FimA蛋白的多克隆抗体提供实验基础。　　研究方法：1.以大肠杆菌BL21(DE3)pLysS为宿主菌，用IPTG诱导fimA表达，通过SDS-PAGE和）（如玻连蛋白和纤维连接蛋白）。人细胞外基质蛋白通过与FimA受体配体的结合在细胞外信号转导中起重要作用。菌毛对基质蛋白有很强的亲和力，而且明显抑制玻连蛋白/纤维连接蛋白与其受体αβ3和配体α

3、5β（在中国仓鼠卵巢CHO细胞株中过度表达）的相互结合。在牙周组织中，菌毛可能通过细胞外基质蛋白受体/配体途径阻断细胞外信号转导。　　菌毛还可介导Pg黏附于牙龈上皮细胞、牙周袋上皮细胞、人口腔上皮细胞、人脐静脉内皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞，附着并凝集人或羊的红细胞等。Umemoto[13]构建了无菌毛的Pg突变株，发现其对人口腔上皮癌细胞的黏附性和侵袭性均降低，接种小鼠后引起牙槽骨丧失的量也减少。其他学者构建了不表达菌毛的Pg缺陷株，发现它们黏附和侵袭人牙龈成纤维细胞[14]、上皮细胞[15]、内皮细胞[16]和树突状细胞[17]的能力也降低，甚至不能黏附。这些研究结果

4、说明菌毛在Pg黏附于口腔上皮细胞的过程中起重要作用。　　此外，研究发现Pg可黏附于唾液覆盖的羟基磷灰石（hydroxyapatitecoatedA基因后，发现突变株与sHAP的黏附能力降低。这些研究结果提示FimA菌毛蛋白在Pg黏附到唾液覆盖的口腔内各种组织表面的过程中起重要作用。　　2）在菌斑形成的早期，菌毛可介导Pg黏附于附着在获得性膜表面的细菌，间接的附着于组织表面　　细菌之间的相互黏附和共聚有助于早期生物膜的形成。链球菌是最先定植于牙齿表面的主要细菌，Pg通过菌毛与链球菌细胞表面的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）高亲合力、高特异性的结合而与链球菌发生共聚，这种

5、相互作用在Pg定植于牙周袋的过程中可能起重要作用。此外菌毛还参与Pg与放线菌、福赛氏类杆菌之间的黏附过程。　　3）有关黏附机制的研究　　现在已经明确Pg黏附于口腔的过程为一种特异性识别过程，菌毛可能为特异性配体，与宿主细胞膜上的特异性受体相互作用[7]。部分Pg菌毛可识别的黏附受体现已明确，如βintegrins[7,19]、上皮细胞的细胞角蛋白14[20]、巨噬细胞（MCs）上的TLR2和CD14[7]。菌毛通过上皮细胞的βintegrins促进Pg与牙龈上皮细胞的黏附，抗βintegrins的抗体能抑制Pg的黏附和侵袭[19]。Pg菌毛通过单核细胞上的TLR2、CD1

6、4和CD11a/CD18，诱导外周血单核细胞IL-6mRNA的产生、细胞因子的分泌、p38促有丝分裂蛋白激酶磷酸化和NF-κB的活化。小鼠腹膜巨噬细胞的实验研究表明，β2integrins（CD11/CD18）是小鼠腹膜巨噬细胞与Pg菌毛黏附的细胞受体；而且β链（CD18）在信号转导中起关键作用。　　综上所述，菌毛可介导Pg黏附于龈沟液中的成分（如人血红蛋白和纤维蛋白原）；人唾液成分（如富脯蛋白PRP、富脯糖蛋白PRG）；乳铁转运蛋白、细胞外基质蛋白；宿主细胞（如牙龈上皮细胞、牙周袋上皮细胞、成纤维细胞、人脐静脉内皮细胞，巨噬细胞等）；口腔内的细菌（如链球菌、放线菌、福赛

7、氏类杆菌）。借助于菌毛黏附于这些物质，Pg可在口腔内进一步定植、侵袭、诱导炎症反应的发生。　　2.1.2引发炎症反应和免疫反应　　Pg附着于口腔内组织细胞后，其抗原成分和毒性产物等可引发白细胞的趋化、吞噬等炎症过程，造成表面组织的损伤——其中Pg菌毛能与脂多糖一起激活宿主的防御机制、诱导多种炎性细胞因子的产生；此外细菌及其产物还通过上皮细胞或者细胞间质进入表层下组织，在组织内繁殖，甚至扩散至全身。　　1）Pg菌毛的白细胞趋化作用　　牙周炎再现了一种重要的中性粒细胞介导的破坏宿主组织细胞的模型。牙周炎的优势病原菌Pg产生的毒力因