bmsa菌毛岛屿pi-2a亚基ap1抗原表位序列原核表达产物的抗原性研究

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1、分类ICS学校代码10136学号201000113萎：萋≈茎93萋黏氏蔗大学硕士学论文BMSA菌毛岛屿PI-2a亚基API抗原表位序列原核表达产物的抗原性研究StudyonAntigenicityoftheProductofProkaryoticExpressionofEpitopeSequenceofAPlSubbunitGeneofPI-2aPiliIslandfromBovineMastitisStreptococcusAgalactiae申请人：刘洋学科专业：预防兽医学研究方向：畜禽传染病发病机制及防制技

2、术研究学位类别：学术学位指导教师：布日额教授论文提交日期：二O一三年五月摘要目的克隆奶牛乳腺炎无乳链球菌PI．2a菌毛岛屿辅助蛋白API基因编码B细胞表位抗原优势序列并构建重组表达载体，实现原核高效表达，进而研究表达蛋白的抗原性，为研究其致病机制及菌毛抗原蛋白的研发提供实验基础和理论依据。方法根据GenBartk公布的牛源无乳链球菌PI．2a菌毛岛屿辅助蛋白APl基因序列设计与合成引物，以牛乳源性无乳链球菌基因组DNA为模板，利用PCR技术获得APl抗原表位序列基因片段，经克隆与序列分析正确后，将其亚克隆至原核表

3、达载体pET-30(a)中，构建重组质粒pET-30a-APl，将其转化到E．coli／BL21(DE3)中，经IPTG诱导表达后，进行SDS—PAGE电泳，Bandscan软件分析表达蛋白图谱，利用Western-blot试验验证重组蛋白的反应原性。利用Ni2+亲和层析法纯化重组蛋白，经弗氏佐剂乳化后免疫家兔，探索其免疫原性，并建立检测免疫抗体滴度的间接ELISA．制备无乳链球菌原生质体，经间接荧光抗体检测方法验证表达蛋白APl为菌体表面蛋白，以进一步证明实验结果的可靠性和科学性。结果经测序和酶切结果表明，成功

4、克隆了奶牛乳腺炎无乳链球菌PI．2a菌毛岛屿辅助蛋白APl编码的B细胞表位抗原序列，并成功构建了原核表达重组质粒，实现原核高效表达，菌体裂解上清中可溶性蛋白含量达到48．5％，重组蛋白的相对分子质量为34ku，纯化蛋白含量达到3．75m∥mL。Western—blot结果表明，重组蛋白具有良好的反应原性，间接ELISA检测免疫抗体滴度结果表明，表达蛋白具有良好的免疫原性，三免后56d的免疫抗体滴度达到l：4200，70d之后依然保持较高抗体滴度。间接荧光抗体检测原生质体膜蛋白结果显示，APl蛋白为镶嵌于细胞膜表面

5、的抗原组分。结论成功克隆牛乳腺炎无乳链球菌PI．2a菌毛岛屿辅助蛋白APl抗原B细胞表位序列，序列含有714bp，编码238个氨基酸残基；构建的原核重组表达载体pEY-30a—APl存大肠柑蔺中得到高效可溶性表达：PI．2a菌毛岛屿辅助蛋白APl抗原具有良好的抗原性，可以作为进一步研究的候选抗原；建立了检测免疫抗体的问接ELISA；无乳链球荫表而蛋白APl为菌体膜表而蛋白，可以作为进一‘步研究其感染机制珂f究的靶轫：分予。关键词：牛乳腺炎尤乳链球菌；PI．2a菌毛岛屿；APl辅助蛋白：抗原性：fHJ接ELISA：

6、原化质体StudyonAntigenicityoftheProductofProkaryoticExpressionofEpitopeSequenceofAPlSubbunitGeneofPI一2aPiliIslandfromBovineMastitisStreptococcusAgalactiaeAbstractObjectivTocloneepitopesequenceofBCellofAP1SubbunitGeneofPI-2aPiliIslandfromBovineMastitisStreptococcu

7、sAgalactiaeandconstructrecombinantexpressionvector．Thehighlyexpresswasachievedandthenantigenicofproteinwasstudiedforprovidedingexperimentalandtheoreticalbasisforthestudyofpathogenesisandtheresearchanddevelopmentofpilusantigenprotein．MethodsApairofprimerswered

8、esignedandsynthesizedaccordingtoAPlSubbunitGeneofPI-2aPiliIslandofbovinemastitisStreptococcusAgalactiepublishedonGenbank．GenomicDNAofbovinemastitisstreptococcusagalaetiaewastemplates，anti