牛乳中致病性金黄色葡萄球菌nebps基因的克隆与原核表达产物抗原性研究

《牛乳中致病性金黄色葡萄球菌nebps基因的克隆与原核表达产物抗原性研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、分类号ICS学校代码10136学号201000112荽：至‘是至一3墓内蒙古民燕大学硕士学、．文牛乳中致病性金黄色葡萄球菌nEBPS基因的克隆与原核表达产物抗原性研究StudyontheCloningandProkaryoticExpressionProductsAntigenicofnEBPSGeneofPathogenicStaphylococcusaureusinMilk申请人：薛晓阳学科专业：预防兽医学研究方向：畜禽传染病发病机制及防制技术研究学位类别：学术学位指导教师：布日额教授论文提交日期：二

2、0一三年五月摘要目的构建牛乳源性金黄色葡萄球菌弹性纤维结合蛋白N端蛋白(N．terminalelastinbindingproteinsofS．aureus，nEBPS)原核表达系统，并对其表达蛋白进行抗原性研究。方法提取金黄色葡萄球菌临床分离菌株的基因组总DNA，参考GenBank公布的金黄色葡萄球菌nEBPS基因序列，利用DNAStar生物信息学软件中Protean功能预测nEBPS基因的抗原表位、亲水性和抗原性指数等参数，应用Primer5．0和Oli906．0生物信息学软件设计克隆引物，经PCR克

3、隆nEBPS基因序列，将其克隆至pET-30(a)表达质粒的多晓隆位点(MCS)，构建重组表达质粒nEBPS．pET-30(a)，将nEBPS-pET-30(a)转入E．coli／BL21(DE3)中构建重组工程菌，用IPTG诱导表达，通过SDS．PAGE电泳分析表达蛋白图谱。再用Western．blot验证免疫反应原性；利用Ni2+亲和层析纯化重组的蛋白，并建立检测免疫抗体的间接ELISA方法，对金黄色葡萄球菌nEBPS表达蛋白免疫家兔血清抗体滴度进行检测；制备金黄色葡萄球菌原生质体，利用间接荧光抗体技

4、术对其细胞膜表面nEBPS蛋白进行定位检测。结果经测序和酶切鉴定表明，成功克隆了金黄色葡萄球菌nEBPS基因序列，成功构建原核表达系统并进行高效表达，表达蛋白的相对分子质量为34KD，蛋白表达量占菌体总量的42．6％，可溶性表达量达到46．5％，纯化蛋白含量达到2．08mg／mL。Western—blot结果表明，重组蛋白有良好的反应原性。间接ELISA检测3免后第58d的家兔血清抗体，其滴度达到l：5100，免疫70d后抗体滴度仍能达到1：4500。经制备金黄色葡萄球菌原生质体细胞，利用间接荧光抗体技术

5、检测膜表面nEBPS蛋白，结果表明该蛋白为膜表面蛋白。结论成功克隆了牛乳中金黄色葡萄球菌nEBPS基因序列，该序列的长度为720bp，编码240个氨基酸残基，构建的重组表达系统获得高效可溶性表达；建立了检测金黄色葡萄球菌免疫抗体滴度的间接ELISA方法；金黄色葡萄球菌nEBPS蛋白为膜表面蛋白。关键词：金黄色葡萄球菌；金黄色葡萄球菌弹性纤维结合蛋白N端蛋白荩因；原核表达；间接ELISA；原生质体Abstractobje以veProkar)roticeXpressionsystembebuiltofelaS

6、tic舶erbindingpro衄鼍N．te咖二protein(N．terminalelastiIlbindingproteinsofS．a扰reus椰黔2“&印办∥DcD∞螂a讹淞，introductionintoE．coli，andstudyofitsi衄岫ologicalpropertlesaIldclillicalapplicationsoftheexpressedprotein·M甜lodsGenolIlicDNAwasextractedfromisolatedstrainofStaphylDc

7、D∞淞口鹏淞，for印itopesites，hydr。p_hilicityandantigenicindexparameterswerepredictedbyDNA?Proteanprogram，desi西apairofprimersapplicationPrimer5·0andOligo6·oso‰艘灿ePCR锄plifiednEBPSgenesequenceofStaphylococcUS口"re淞IlEBPSgenesequence舶mG矗aIll【．m触啡ntwaScl。ned幽memultipl

8、ecl。ningSite(MC∞0fpET。30(a)t0cons协lct妣recombinantprokaryoticexpressionVectornEBPS。pET-30(a)·TherecombinantplasmidnEBPS．pET-30(a)wastransformedintoBL21(DE3)andtlleBL21／nEBPS—pET-30(a)wasinducedbyIsopropyl⋯PDthioglact