牛源金黄色葡萄球菌fnbpa a区和d区基因的原核表达及免疫学特性研究

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1、内蒙古农业大学研究生学位论文独创声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包括其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包括为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：．么刍筮一一日期：地，丕：厶一内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属内蒙古农业大学。本

2、人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙古农业大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为内蒙古农业大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：—扯指导蝴签名：都蚴日摘要金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的主要病原菌之一，它对乳腺上皮细胞的黏附和定殖被认定为主要致病机制。因此，阻断金黄色葡萄球菌的黏附和定殖，可能是预防感染的有效策略。．纤连蛋白结合蛋白A(FnBPA)是与金黄色葡萄球菌致病性相关的重要的毒力因子。纤连蛋白结合蛋白A

3、的A区(FnBPA-A)主要与纤维蛋白原(№)结合，D区(FIlBPA．D)主要与纤维结合素(Fn)结合。本研究采用PCR技术对牛源金黄色葡萄球菌FnBPA．A和FIlBPA-D进行特异性扩增，并构建克隆质粒。然后将目的片段与原核表达载体pET-32a(+)连接，并进行IPTG诱导表达。表达产物经SDS．PAGE电泳检测，显示重组目的蛋白FnBPA-A和FnBPA-D的分子量大小分别为102KDa和53KDa。为评价金黄色葡萄球菌黏附素蛋白FnBPA-A和FnBPA-D基因的免疫原性优劣，分别将纯化的重组原核表达FnBPA-A和．FnBPA-D蛋白免疫新西兰白兔。通过ELISA方法检测免疫兔

4、血清的抗体效价、细胞因子表达水平并进行T淋巴细胞增殖试验、全血调理吞噬试验。结果表明，在免疫35d抗体水平分别可达l：12800(FnBPA—A)、l：25600(FnBPA-D)；同时，两者均能提高兔体内IL．2、IL4、IL-10和IFN吖的含量，且FnBPA-D组显著高于FnBPA-A组(p<0．05)；FnBPA-D蛋白免疫组刺激指数显著高于FIlBPA-A蛋白免疫组(p<0．05)；并且FllBPA-A、FnBPA-D免疫组的全血杀菌能力均显著高于对照组(p<0．05)。综上所述，FnBPA-A和FnBPA-D蛋白均可诱导机体产生较好的体液免疫和细胞免疫反应，且FnBPA-D较Fn

5、BPA-A效果更佳，更适合作为奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌亚单位疫苗的候选蛋白。关键词：金黄色葡萄球菌；FnBPA．A；FnBPIA．D；原核表达；免疫原性ProkaryoticExpressionandImmunologicalCharacteristicsStudyoftheAandDDomainofFibronection．bindingProteinAfromStaphylococcusaureusAbstractStaphylococcusaureusisoneofthemostsignificantpathofenswhichcausesthebovinemastitis．S．aur

6、eusadhesionandcolonizationinthemammaryepithelialcellswasidentifedasitsmainpathogenicmechanism．TheeffectiveatrategyforpreventinginfectionmaybeblockingS．aureusadherensionandcolonizationtothehostcellsurface．Fibronection-bindingproteinA(FnBPA)isconsideredtobethemajorvirulencefactorsofS’aureus．TheAdomai

7、nofFibronection-bindingproteinA(FnBPA—A)ismajorcombinedwithfibrinogen(Fg)，andtheDdomainofFibronection-bindingproteinA(FnBPA-D)ismajorcombinedwithfrbronection(Fn)．Inthispaper,FnBPA-AandFnBPA-DgeneofS．aureusw