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时间:2019-03-17
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1、牛SPAG11D基因的原核表达及其抑菌活性研究-农学论文牛SPAG11D基因的原核表达及其抑菌活性研究胡修忠,凌明湖,王定发,程蕾,向敏,刘晓华,夏瑜(武汉市畜牧兽医科学研究所,武汉430208)摘要:为了检测重组蛋白SPAG11D的抑菌活性,提取牛睾丸组织总RNA,经RT-PCR扩增了SPAG11D基因,将该基因插入pET-32a(+)融合表达载体,并转入BL21(D3)进行原核表达,通过改变IPTG浓度和诱导时间优化表达条件,并用琼脂扩散法测定重组蛋白体外抑菌活性。结果显示,成功扩增牛SPAG11D基因,产物大小为3
2、90bp,其序列与GenBank公布序列相一致;正确构建了原核表达载体pET-32a(+)-SPAG11D,重组蛋白最佳表达条件为IPTG终浓度1.0mmol/L、诱导时间为4h;表达产物的分子质量约为33kDa;该重组蛋白对霍乱弧菌具有明显的体外抑菌活性。本研究成功构建了牛SPAG11D基因的原核表达载体,并获得了具有抑菌活性的重组蛋白His-SPAG11D。关键词:牛;原核表达;SPAG11D基因;抑菌作用中图分类号:S823文献标识码:A文章编号:0439-8114(2015)05-1135-04DOI:10.14
3、088/j.cnki.issn0439-8114.2015.05.027收稿日期:2014-12-16基金项目:武汉市农业科学技术研究院创新基金项目(CX201245)12/12作者简介:胡修忠(1980-),男,山东曹县人,畜牧师,主要从事动物遗传育种与繁殖工作,(电话)027-81776323(电子信箱)hu_xiu_zhong@126.com。精子相关抗原11(Spermassociatedantigen11,SPAG11)是精子膜上的一种蛋白,也是β防御素的一种,由2个相互独立的β防御素基因通过通读转录连接到一起
4、[1],主要在哺乳动物的睾丸、附睾和雄性生殖道中表达。SPAG11被认为在雄性生殖道的先天免疫、精子的成熟以及透明带的识别和精卵结合等事件中起到重要的作用[2-4]。雄性生殖系统的病原感染严重威胁其生殖和内分泌功能,如沙眼衣原体可以引起附睾炎并阻碍附睾内精子的运动[5]。而SPAG11蛋白能够抵御病原微生物对机体生殖道的侵害。对人的SPAG11各蛋白亚型研究表明,其N-端都具有抗菌活性,而且人的SPAG11C蛋白抗大肠杆菌活性远大于该亚型N-端的抗菌活性[6,7]。此外还发现,猕猴的SPAG11蛋白也具有抗菌活性。目前认
5、为SPAG11在精子通过附睾的过程中参与精子的成熟。Zhou等[4]发现大鼠附睾头部的SPAG11E蛋白结合在精子的头部,在附睾尾部的蛋白结合在精子顶体后部,这表明SPAG11E蛋白在精子通过附睾时对精子起一定的修饰作用,此外SPAG11E蛋白能够提高未成熟精子的运动能力。在牛体内共发现6种SPAG11蛋白亚型:SPAG11C、SPAG11D、SPAG11E、SPAG11U、SPAG11V、SPAG11W[8],它们存在于睾丸、附睾、输精管上皮以及非生殖道组织中。余树民等[9]在牦牛生殖器官中也检测到了这6个亚型的表达。
6、112/12材料与方法1.1试剂Trizol试剂购自Invitrogen公司;cDNA反转录试剂盒、TaqDNA聚合酶、HindIII和BamHI限制性内切酶均购自TaKaRa公司;T4DNA连接酶购于Biolabs公司;EasyPurePlasmidMiniPrepKit质粒快速提取试剂盒、EasyPureQuickGelExtractionKit琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司;TEMED购自Amresco公司;异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)购自Merck公司;氨苄青霉素(Amp
7、)购自Sigma公司;丙烯酰胺、过硫酸铵、乙二胺四乙酸(EDTA)、十二烷基硫酸钠(SDS)等均为国产分析纯试剂。1.2菌种和质粒E.coliDH5α、BL21(DE3)购自北京全式金生物技术有限公司;pET-32a(+)、金黄色葡萄球菌、霍乱弧菌O139、大肠杆菌O157、大肠杆菌K88、大肠杆菌K199和沙门氏菌为本实验室保存。1.3试验动物刚出生的小公牛。1.4引物设计根据GenBank上公布的牛抗精子抗体SPAG11D(KC899318.1)基因的核苷酸序列设计特异引物:P1:5′-CGGGATCCATGAAGC
8、AATTCCTCGC-3′,P2:5′-CCCAAGCTTCTAGGTGCCTGATCTG-3′1.512/12SPAG11D基因的克隆和测序取小公牛睾丸和附睾组织,于液氮中保存。RNA提取参照文献[10]的方法提取组织的总RNA,以Olig(dT)为引物反转录生成第1链cDNA。以P1、P2为引物扩增SPAG11D
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