原核基因表达及其调控

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1、第二章原核微生物的基因表达与操作2.1原核微生物的基因表达及其调控2.2原核微生物的基因表达产物的分离纯化（1）转录因素；（2）翻译因素；（3）蛋白质的稳定性；（4）胞外分泌的特性一、原核生物的基因表达第一节原核生物的基因表达与调控因素（一）、转录对基因表达的影响要注意的关键名词术语:1)编码链（有义链，thecodingstrand）;6)转录单位（Atranscriptionunit）;2)反义链（模板链，thetemplatestrand）;7)上游（Upstream）;3)RNA聚合酶（RNApolymerase）;8)下游（Downstream）;4)启动子（Apr

2、omoter）;9)转录起始位点(Startsite);5)终止子（Aterminator）;10)初始转录产物Aprimarytranscript新生RNA序列与模板链互补；与编码链相同。原核生物RNA聚合酶大肠杆菌提取的RNA聚合酶：由五个亚基组成，分子量为500kDa。核心酶（2ββ’）：转录功能单位全酶（2’）（coreenzyme）（holoenzyme）σ因子：参与识别特异的启动子原核生物RNA聚合酶能被利福平（rifampicin）所抑制。利福平与β亚基相结合，从而抑制酶的活性。RNA聚合酶可形成1个中间管道(二)、原核生物基因的翻译起始因子Initi

3、ationfactors(IFs)可稳定自由状态的30S亚基；以及结合起始tRNA到30S-mRNA复合物上二、可调控启动子驱动的基因表达微生物表达系统：（1）功能基因；（2）载体；（3）受体菌：大肠杆菌枯草芽胞杆菌其它细菌受体菌酵母菌昆虫细胞哺乳动物细胞等E.coli用作受体菌的优势：（1）对其遗传学背景、分子生物学、生物化学和生理学方面的了解较为深入；（2）很多目的基因能在E.coli中迅速而有效地表达；（3）其培养条件易于掌控，培养费用相对较低。。启动子：DNA分子中与RNApolI发生特定结合的序列，启动转录过程。启动子有强/弱之分。E.coli的启动子：（1）-10

4、region：TATAbox（Pribnowbox）T77A76T60A61A56T82（2）-35region：为RNApolI初始结合区。T69T79G61A56C54A54非调控启动子：对细胞产生伤害(1)持续性地高水平表达某一目的基因会过分消耗宿主细胞的营养和能源，最终造成致死效应;(2)由于使宿主细胞处于生长的逆境，容易发生载体质粒的丢失；(3)非调控性地表达外源蛋白，容易受到蛋白酶的水解作用，从而使最终的蛋白量并不高；(4)形成不溶性的包含体蛋白。（一）可调控启动子(RegulatablePromoters)：大肠杆菌中已开发5种可调控启动子(1)Plac启动子：

5、即E.colilac启动子;(2)Ptrp启动子：即E.colitrp启动子；(3)Ptac启动子：由lac和trp组成的杂合启动子。即E.colilac(-10区)＋E.colitrp(-35区)(4)PL启动子：基于噬菌体的启动子；(5)Pt7启动子：噬菌体T7的基因10启动子可调控启动子的特征：（1）通过与阻遏蛋白的相互作用，提供一个开关系统，使启动子能在特定条件下发生关闭或者开放；（2）容易被大肠杆菌的RNA聚合酶全酶所识别。四种简单类型控制通路诱导作用是指存在诱导物能使阻遏蛋白失活，或者可激活一个激活蛋白而解除阻遏蛋白对转录起始过程的阻遏；阻遏作用是指一个辅阻遏物

6、激活一种阻遏蛋白，或者使一种激活蛋白失活而对转录过程发生阻遏作用。lac启动子：（1）lac启动子来源于大肠杆菌的乳糖操纵子，包括启动子、活化蛋白（cataboliteactivatorprotein,CAP）结合位点、操纵基因和lacZ组成。（2）lac启动子受到阻遏蛋白（repressor）的负调控，而受到CAP和cAMP的正调控。其中CAP的正调控是通过增加启动子与RNA聚合酶的亲和性而起作用。(3)lac启动子由于与阻遏蛋白相结合而处于关闭状态，但当加入乳糖或者半乳糖苷结构类似物，如异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、硫甲基半乳糖苷（TMG）和邻硝基苯基半乳糖苷（ONTG

7、）后可发生脱阻遏作用。乳糖操纵子基因产物:1)lacI:阻遏蛋白;2)lacZ：-半乳糖苷酶；3)lacY：透性酶;4)lacA：硫代半乳糖苷转乙酰基酶cAMP参与乳糖操纵子的调控：（1）cAMP通过与cAMP受体蛋白（CRP）结合，引起CRP构象变化，形成一种有活性的cAMP-CRP复合物；（2）乳糖操纵子启动基因（O）有2个位点：一个与RNA聚合酶结合；另一个与cAMP-CRP结合，而且只有后者结合后才能与启动基因结合，启动转录过程；（3）cAMP-CRP复合物不仅可以与一个启动基因结合，而且还可