犬瘟热病毒n蛋白基因的克隆、原核表达及其重组蛋白的抗原性研究

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1、犬瘟热病毒N蛋白基因的克隆、原核表达及其重组蛋白的抗原性研究摘要犬瘟热是由犬瘟热病毒（Caninedistempervirus，CDV）感染犬或其它食肉目动物引起的高传染性、致死性疾病，以双相热、红疹、结膜炎、白细胞减少及中枢神经系统损害为主要特征，为危害特种养殖业发展的一类重要疾病。因该病没有特效药物进行治疗，所以对本病的预防和早期诊断就尤为重要。本研究主要包括以下三部分：1犬瘟热N蛋白基因的克隆及序列分析参考GenBank中发表的CDVN蛋白基因序列，用oligo6.0软件设计一对特异性引物，从患犬瘟热的犬全血样品中提取总RNA，经RT-PCR扩增得到1572bp的基因片段，将其插入pMD

2、18-T克隆载体中构建了pMD18-CDVN重组质粒，并将其转入到大肠杆菌DH5α中，进行鉴定、测序。序列分析表明克隆的CDVN蛋白基因从起始密码子ATG开始到终止密码子TAA结束全长为1572个核苷酸，与GenBank中发表的CDVN蛋白基因序列相比同源率达到93.9％-99.1％。2犬瘟热N蛋白基因的原核表达及重组蛋白的反应原性研究将CDVN蛋白基因与原核表达载体pGEX-4T-2连接构建了pGEX-4T-2-CDVN重组质粒，将其转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，进行鉴定、测序、IPTG诱导表达。Westernblot分析显示表达产物为84kDa的重组蛋白，可被犬瘟热抗血清所识别，具有

3、良好的反应原性。3犬瘟热N蛋白基因原核表达条件的优化、重组蛋白纯化及免疫原性研究为了提高GST-CDVN重组蛋白在大肠杆菌中的可溶性的表达量，对GST-CDVN重组蛋白在大肠杆菌中的多种表达条件进行了研究，选择最佳条件进行高效表达，用GST-Sepharose4B亲和层析柱对GST-CDVN重组蛋白进行纯化，得到最大量的可溶性重组蛋白。通过免疫小鼠证明了GST-CDVN重组蛋白具有良好的免疫原性。本研究成功克隆、表达了犬瘟热N蛋白基因，纯化得到了具有很强抗原性的重组蛋白，为建立犬瘟热ELISA诊断试剂盒提供了可能，为亚单位疫苗的研制提供了依据。基础关键词：犬瘟热病毒；N蛋白基因；克隆；原核表达

4、；抗原性IIICloningandProkaryoticExpressionofNProteinGeneofCanineDistemperVirusandAntigenicityoftheRecombinantProteinAbstractCaninedistemperisakindofinfectiousandfataldiseasewhichaffectedonthedevelopmentofspecialstraincultivationindustry,causedbycaninedistempervirusinfectingcanineandothercarnivoraanimal.

5、Theclinicalfeaturesarediphasicfever,roseola,conjunctivitis,leucocytopenia,andcentralnervoussystemdamage.Itisparticularlyimportanttopreventandearlydiagnose,becausenowitdoesn’thavespecificmedicinetocure.Thefollowingthreestudieswereconductedinthepresentarticle.1CloningandsequenceanalysisofNproteingeneo

6、fcaninedistempervirusOnepairofthespecialprimersweredesignedbyoligo6.0softwareaccordingtotheNproteingenesequencesofcaninedistempervirus(CDV)publishedinGenBank.A1572bpCDVNproteingenefragmentwasamplifiedbyRT-PCRfromthetotalRNAtemplateinthewholebloodsamplesinfectedbyCDV,anditwasclonedintoapMD18-Tvectort

7、oconstructpMD18-CDVNrecombinationplasmid.SequenceanalysisshowedthatthetotallengthofCDVNproteingenewas1572nucleotidesfromstartcodonATGtostopcodonTAA,andthehomologyofthenucleotidesequencewas93.9%-99.1%c