p53基因表达沉默的稳定Vero细胞系的建立及特性分析

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1、生物技术通报·研究报告·BIOTECHNOLOGYBULLETIN2010年第7期p53基因表达沉默的稳定Vero细胞系的建立及特性分析刘超邱亚峰沈阳刘庆伟马志永(中国农业科学院上海兽医研究所兽医公共卫生研究室，上海200241)摘要:利用慢病毒介导的RNA干扰技术，建立稳定沉默p53基因的Vero细胞模型。设计针对p53基因的shRNA序列，构建p53shRNA慢病毒载体并感染Vero细胞;嘌呤霉素筛选阳性细胞，局部消化法挑选细胞克隆;利用RT-PCR和West-ernblot检测p53的表达水平;利用虫荧光素酶报告系统，分析p53的转录激

2、活功能。RT-PCR和Westernblot结果显示，慢病毒介导的shRNA有效地沉默p53基因表达;与对照组细胞相比，干扰组细胞的p53的转录激活功能明显降低。慢病毒介导的shRNA高效、稳定地沉默了p53基因的表达，同时，有效地降低了p53的转录激活功能，为研究p53的生物学功能提供了有利的工具。关键词:p53慢病毒载体RNA干扰筛选细胞系GenerationandCharacteristicAnalysisofaStableVeroCellLinewithp53GeneExpressionKnocked-downUsingLentivi

3、ralVector-mediatedShortHairpinRNALiuChaoQiuYafengShenYangLiuQingweiMaZhiyong(LaboratoryofVeterinaryPublicHealth，ShanghaiVeterinaryResearchInstitute，ChineseAcademyofAgriculturalSciences，Shanghai200241)Abstract:ThestudywastoestablishastableVerocelllinewithp53genesilencingusin

4、glentivirus-mediatedRNAinterference(RNAi)．VerocellswereinfectedwitharecombinantlentivirusexpressingaspecificshRNAforp53gene．ThepositivecellcloneswereselectedusingselectivedrugofPuromycin，andisolatedusingthemethodofpartialdigestion．Theexpressionofp53wasdetectedbysemi-quantit

5、ativeRT-PCRandWesternblot．Thep53transcriptionactivityofthenegativecontrolandp53RNAiVerocellswasana-lyzedwithaluciferasereportsystem．TheVerocelllinewithp53genesilencingwasobtained．Theanalysisofsemi-quantitativeRT-PCRandWesternblotshowedthattheexpressionofp53wassubstantiallyd

6、own-regulatedbyRNAi．Thep53transcriptionalactivityinRNAicellswassignificantlydecreasedcomparedwiththatinnegativecontrolcells．Theresultsdemonstratedthatthelentiviralvector-media-tedshorthairpinRNAhaseffectivelyandspecificallysilencedp53geneexpressionandconsequentlydown-regula

7、tedthep53transcrip-tionalactivityinthegenerated-p53RNAiVerocellline．ThisRNAicelllinewasappearedtobeausefultoolinstudyingthebiologicalfunctionofp53．Keywords:p53LentivirusvectorRNAinterfereScreeningCellline［2］在各种动物细胞中，p53基因具有非常相似的路非常复杂，具有参与细胞周期调控，细胞分化［3］［4］基因结构，长约20kb，都由11个外显

8、子和10个内与衰老，DNA修复与诱导细胞凋亡等多种生物［1］含子组成。而p53蛋白在细胞内的信号转导通学功能。收稿日期:2010-03-15基金项目:国家自然科学基