稳定表达犬瘟热病毒受体nectin--4的vero--e6细胞系构建

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1、万方数据EstablishimentofVero—E6CellLineStablyEXpressingCanineDisteInperVimsReceptorNectin一4Thesissubmittedto如D内砒“厉配纪厂训佗觇疵砂InFumⅡmentoftheRequirementfortheDegreeofMaSterOfAgrOnOmyV，YhZekunCoⅡegeofAnimalScienceandV．eterinaryMedicineSuperVisor：Pro￡ShaⅡHuQingdao．ChinaJune．2014万方数据独创性声明本人声明所呈交的论文是

2、我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：五舞^咔时问：7带．够年乡月“日／＼关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、

3、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守．岫渺议)一虢习洚叶帆撕y“月诺日导师签名：时间：≥矿j匕年么月澎日万方数据青岛农业大学硕：上学位论文摘要由于犬瘟热病毒为单股负链的RNA病毒，在自然环境中不易存活，需要在传代细胞中增殖以实现长期保存并达到人工制弱及制备疫苗的目的。但常规传代细胞不具有介导犬瘟热病毒侵染的特异性受体，表现出对犬瘟热病毒的不敏感，需要将细胞改造使其表达感染受体以增加对犬瘟热病毒的敏感性。本次试验通过克隆犬瘟热病毒受体Nectin．4，在ver0．E6细胞中表达获得了稳定细胞系，为犬瘟热病毒的进一步分离打下了基础。为了解分析Bealg

4、e犬Nectin一4分子基因和氨基酸序列的同源性及种间保守性，试验一根据Genebank登陆的已有物种Nectin．4序列设计引物，通过RT_PcR方法从雌性比格犬胎盘和肺组织中成功获得比格犬Nectin-4全序列cDNA并对其进行了分析。结果显示：Nect{n．4分子开放阅读框为1530bp，编码509个氨基酸，为典型的免疫球蛋白超家族V-C．C结构。经比对分析比格犬Nectin．4与已公布的拉布拉多犬序列同源性为99％，物种间保守性均高于90％，且犬瘟热病毒结合位点高度保守。将Nectin一4基因片段上下游引物5’端分别引入EcoRI酶切位点、Kozak序列及FIag

5、标签、SaII酶切住点，通过EcoRI、SalI双酶切方法获得相同的粘性末端并使用T4连接酶引入pⅡ汪S2．EGFP真核表达载体中，使用5倍体积Lipfectamine蹦2000将重组质柱瞬时转染至vero．E6细胞中，通过增强型荧光蛋白、间接免疫荧光方法及RT_PCR方法确定蛋白成功表达，Westem-blot试验获得约为56kDa的目的蛋白条带，对Vero—E6细胞多组分分别染色，确定目的蛋白在信号肽的引导作用下可以自然定位于细胞膜表面，可用于病毒侵染分离。vero—E6细胞分别使用100肛∥mI-lloo陷／ml建立G418浓度梯度，选定600鹏／ml为最终工作筛选

6、浓度。通过有限稀释法将筛选阳性细胞单克隆化至96孔板，并进行鉴定培养，筛选表达Nectin-4蛋白的细胞扩大培养，反复单克隆化挑选3次选取表达量最高的细胞株，使用减半筛选浓度继续传代，在多个代次中均检测到mRNA转录及目的蛋白的袁达，获得了稳定表达株。关键词：比格犬，Nectin。4，、^Iro．E6细胞系万方数据青岛农业大学硕士学位i=仑文AbstraclAbstractCanineDistemperVirus，CDVbelongtosinglestrandnegatiVechainRNAViruseswhichwashardtosun，iveinnaturalcond

7、ition．CDVcouldr印licatejnpassagecellsandbeusedtoproduceVaccineanddia印osticreagent．Ordinarypassagecells，whichlackparticuladyrec印torforVirusadhesion，wasinsensitiVetowild—typeCDVOrdinarycellsneedtransfonnationinordertojmproVethesens．bilitytoCDVwithoutchangingofVirusanti