猪流行性腹泻病毒bd株的分离鉴定及稳定表达papn基因vero细胞系的构建

《猪流行性腹泻病毒bd株的分离鉴定及稳定表达papn基因vero细胞系的构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、万方数据分类号：—$852．—659．6密级：公珏单位代码：学号：!QQ星鱼2011422猪流行性腹泻病毒BD株的分离鉴定及稳定表达pAPN基因Vero细胞系的构建IsolationandIdentificationofPorcineEpidemicDiahorreavirusstainBDandEstablishmentofVerocelllinestableexpressingPorcineAminopeptidaseNGene学位申请人：杨震指导教师：范京惠副教授左玉柱副教授学科专业：预防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：；n-IjL农业大学答辩日

2、期：二。一四年五月三十一日万方数据独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑皇垦盛些盘堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位敝作者签名：栖良签字嗍础年6月z日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解塑皇垦盔些盘鲎有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。

3、本人授权塑主垦塞些盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：物莨签字日期：为咔年6月2日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：导师签名：茏京忽．签字日期：如I々年‘月土日电话：邮编：万方数据摘要猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea，PED)是引起猪以腹泻、呕吐和脱水为主要特征的肠道传染病。不同年龄和不同品种的猪均易感，哺乳仔猪死亡率达95％以上。近年来，PED的流行区域有逐渐扩大的趋势，在世界各地广泛

4、传播，造成巨大的经济损失。因此，PED的及时确诊和防治研究具有重要的意义。本试验首先将经RT．PCR鉴定为PEDV阳性的腹泻仔猪粪便，小肠及内容物样品，在Vero细胞上连续传代，分离病毒，并通过稳定的细胞病变、病毒的TCID50测定、RT．PCR扩增试验、IPMA、间接ELISA试验等方法对该分离毒进行了鉴定，并进行连续传代。试验结果表明：病毒盲传22代，未出现明显的病变，第23代48h出现可见CPE。为进一步证明这种病变是由PEDV所引起的，本试验采用RT．PCR技术扩增PEDVS基因，结果为阳性；单层过氧化物酶试验细胞胞浆中出现弥漫状棕色着染，说明细

5、胞感染PEDV；间接ELISA检测，判断此细胞培养毒为阳性；对第23代病毒测定TCID50结果为10。2‘5／O．05“。由以上的试验可以证明从粪便里分离出的这株病毒为PEDV，此毒株的获得为我国研究河北地区PEDV的血清学、免疫学、病原生物学特性以及疫苗的研制等提供了重要的物质基础。为了提高病毒在Vero细胞上的产量，本试验从猪肠道黏膜基因组中扩增出pAPN．SPC段基因，插到带有EGFP的真核细胞表达载体pEGFP-NI中，经BamHI及EcoRI酶切鉴定正确后转染Vero细胞，构建了能够表达猪pAPN．SPC段的真核细胞表达载体pEGFP-N1．p

6、APN．SPC，并在Vero细胞中进行有效表达，24h荧光显微镜观察荧光亮度较弱，48h后荧光亮度较强，然后用G418进行筛选获得转染后的阳性细胞。通过RT．PCR检测到目的条带，表明pAPN．SPC基因存在于基因组中，通过Western—bloting观察到重组质粒转染后的细胞产物中显示52ku的条带，表明pAPN—SPC蛋白在Vero细胞中获得表达。最后用荧光定量PCR检测此细胞系对病毒量增殖的影响，利用2。△△C’o法，得出转染组的数值是对照组的1．17倍，病毒量明显提高，表明此人工建立的细胞系能够有效提高病毒的产量，对进一步研究PEDV感染机制及

7、pAPN功能等都有较高的参考价值。关键词：猪氨基肽酶；真核表达；猪流行性腹泻病毒；Veto细胞系万方数据IsolationandIdentificationofPorcineEpidemicDiahorreavirusstainBDandEstablishmentofVerocelllinestableexpressingPorcineAminopeptidaseNGeneAbstractCandidate：YangZhenSupervisor：Prof．FanJinghuiSpeciality：PreventiveVeterinarySciencePo

8、rcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)causesle