猪流行性腹泻病毒的分离及间接elisa的建立

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1、分类号蔓宣55：墨UDC硕士学位论文猪流行性腹泻病毒的分离及间接ELISA的建立郭旋学科专业预随兽医堂指导教师黄鱼坚数援论文答辩日期2Q131Q5128学位授予日期——。——广西大学学位论文原创性和使用授权声明本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除已特别加以标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料。与我一同工作的同事对本论文的研究工作所做的贡献均已在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品

2、，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，即：学校有权保存并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于：口保密，在年解密后适用授权。彰不保密。(请在以上相应方框内打“√”)论文作者签名：邻1起指导教师签名：毫件坚作者联系电话：fsc7777邝1秒己f日期：2DJ弓年石且膨日日期z。I埠洱阳．电子邮箱：乡nD×Ⅱ口nz彤，z因／如．伽川猪流行性腹泻病毒的分离及间接ELIS

3、A的建立摘要猪流行性腹泻(PorcineEpidemicDiarrhea，PED)是世界范围内发生的猪病之一，1978年在英国和比利时首次被报道，此后欧洲、亚洲的多个国家相继报道了PED的发生，造成严重的经济损失。当前，PED发生率居高不下，并出现混合感染的报道(如猪传染性胃肠炎、猪轮状病毒、猪圆环病毒2型)，倍受广大研究者的重视。本研究对猪流行性腹泻病毒(PorcineEpidemicDiarrheaVirus，PEDV)进行分离鉴定和分子流行病学调查及建立其抗体的间接ELISA诊断方法，以进一步了解PEDV广西流行毒株的特点，为下一步研制PE

4、DV疫苗、制备诊断试剂盒提供理论指导，为更好地防控PED奠定基础。了解当前PEDV在广西的流行情况，本研究用RT．PCR方法对2011年2月至2013年1月间从广西11个市采集的240份腹泻仔猪样品进行PEDV检测，发现PEDV阳性率为41．7％(100／240)，四个季度均存在PEDV的感染，其中春、冬季节的检出率最高，分别为49％和46．2％。调查结果表明，在广西大部分地区的猪群中普遍存在流行性腹泻病毒感染。对阳性材料进行克隆，获得了14条M基因序列和20条ORF3基因序列。用DNAStar、MEGA5．0软件将其与国内外相应的基因序列进行比

5、较分析发现，本实验所获得的M、ORF3序列差异较大，它们与2010年以来我国广东、福建、江苏、江西四省的同源性均较高，与泰国、韩国2007年以来的流行毒株亲缘关系也非常密切，但与我国2006年前分离的毒株及CV777株、日韩弱毒株较远。且在从腹泻仔猪样品克隆所得的序列中，有1条M基因序列与CV777疫苗株相近，有3条ORF3序列与CV777、attenuated．DRl3疫苗株存在相似的49个核苷酸的连续缺失。这些结果提示我们要加强对PEDV的研究与监控，采取更有针对性的免疫与防控措施。本次研究是首次对广西当前的流行毒株进行比较深入的分子流行病学

6、调查。为进一步了解广西流行毒株的生物学特性，研究通过用VERO细胞对40份阳性材料进行分离，经RT．PCR鉴定和间接ELISA鉴定，获得一株能稳定传代并能使细胞发生空泡化、溶解、相互融合、出现拉网等细胞病变的毒株，命名为PEDV．LB。对其S、ORF3、M、N4个基因进行克隆测序，并将其与国内外相应的基因序列进行同源性比较与遗传进化树分析，发现ORF3基因、M基因与CV777等弱毒株比较相近；N基因与CH／GDS／09，亲缘关系最近，与CV777不在同一分支上；S基因变异较大，与我国2011年的流行毒株同源关系较近，与CV777等距离较远。根据C

7、V777全基因序列设计引物进一步对PEDV．LB株全基因进行克隆，结果获得了除5’端、3’端及部分Pol基因外的全基因大部分核苷酸序列，共25，094bp。为了建立PEDV抗体检测的间接ELISA诊断方法，本研究对广西流行毒株的N基因进行克隆，设计合成引物扩增其局部强亲水性抗原决定簇基因区域(135．319位氨基酸)NB，构建了NB．PET32a．BL21重组原核表达质粒，经IPTG诱导获得重组N蛋白。SDS．PAGE电泳结果表明表达产物部分可溶，经Western．Blm鉴定，表达的重组N蛋白含有His．Tag，能够被抗His的抗体识别，还能PE

8、DV阳性血清所识别，具有良好的抗原性。将纯化的重组N蛋白包作为抗原包被酶标板，通过优化反应条件，建立了检测PEDV抗体的间接ELISA方