猪博卡病毒间接elisa诊断方法的建立

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1、AGRICULTURALUNIVERSITYOFHEBEI硕士学位(毕业)论文猪博卡病毒间接ELISA诊断方法的建立学位申请人:郑英帅指导教师：孙继国教授袁万哲副教授学科专业滪防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一五年五月二十四日独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研宄成果。据我所知’除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研宄成果，也不句,含为获得河北农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本

2、研宄所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名:7签字日期：并#年今月：学位论文版权使用授权书太登位论IT作者完含了解河北农业大学有关保留、使用学位论文的规定’有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘’允许论文被查阅和借阅。太人桴权河北农业大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名:导师签名:签字日期年》月叶日签字日期年巧月f曰学位论文作者毕业后去向:工作单位

3、：电话:由扁通讯地址:分类号:S851.34单位代码:10086密级:公开学号:2012362猪博卡病毒间接ELISA诊断方法的建立TheEstablishmentofIndirectELISAforDiagnosisofPorcinebocavirus学位申请人：郑英帅指导教师：孙继国教授袁万哲副教授学科专业：预防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一五年五月二十四日摘要猪博卡病毒(PBoV)最早于2009年在瑞典被发现，迄今为止，对于其传播方式，侵染机制，及其基因组功能都不甚明了，但是世界各

4、国学者在进行该病毒的流行病学调查时发现，该病毒在PMWS患猪中阳性率较高。另外还有学者提出猪博卡病毒可能与呼吸道疾病病原共感染机体。目前大多认为其基因组编码3个开放阅读框(ORF)分别对应非结构蛋白NS1、抗原蛋白VP、和非结构蛋白NP1，VP蛋白为猪博卡病毒主要的抗原蛋白，但变异性较高，非结构蛋白NP1，编码一个相对保守且高度磷酸化的非结构性蛋白质。目前世界各国对该病毒的检测也仅仅局限于一些不成熟的PCR检测方法，并无血清学检测方法的问世，因而有效的血清学诊断方法的研究迫在眉睫，本研究成功的在河北地区病猪体内提取出猪

5、博卡病毒基因，分别对NP1基因和VP2基因进行B细胞线性抗原表位的预测分析，并对保守的NP1基因和截短的相对保守的VP2基因进行克隆表达，分别将纯化的NP1蛋白和VP2截短蛋白作为包被抗原，经过优化条件和相对比较建立了快速检测猪博卡病毒病的血清学诊断方法。根据NCBI系统中GenBank已发表的猪博卡病毒NP1和VP2基因序列，设计合成特异性引物，采用降落PCR技术扩增NP1基因和截短的VP2基因序列，克隆后进行测序，测序正确后进行克隆载体与加酶切位点的目的片段的连接转化，并分别将质粒命名为PMD-NP1和PMD-VP

6、2。对重组质粒PMD-NP1和PMD-VP2进行双酶切得到带酶切位点的NP1基因和截短的VP2基因并将其与原核表达载体pET32a连接，构建表达质粒pET32a-NP1和pET32a-VP2。经IPTG诱导后SDS-PAGE电泳可分别检测到分子质量约为44ku和35ku的蛋白，与预期的蛋白分子量大小基本一致，以可溶性形式存在于上清中，同时在包涵体中也大量存在。利用原核表达载体pET32a上带有的His标签对pET32a-NP1和pET32a-VP2重组蛋白进行纯化，纯化蛋白经Western-blotting结果显示，重

7、组蛋白与PBOV阳性血清具有良好的反应原性。表明分子质量约43ku和37ku的蛋白即为目的蛋白。以纯化的两种重组蛋白分别作为包被抗原，通过对各自反应条件的优化，建立了检测PBoV抗体的间接ELISA检测方法，并比较两种ELISA检测方法。优化结果显示，以NP1蛋白为包被抗原的抗原最佳包被浓度为4µg/mL；封闭液为2%的明胶工作液；阴阳性血清最佳稀释度为1∶80，二抗的最佳稀释度为1∶1000，底物显色时间为10min。该方法与CSFV、PRRSV、PPV、PCV2阳性血清不发生交叉反应，批内和批间重复性试验的变异系数

8、(CV)均值都小于10%，而以VP2蛋白为包被抗原的抗原最佳包被浓度为2µg/mL；封闭液为2%的明胶工作液；阴阳性血清最佳稀释度为1∶80，酶标抗体最佳稀释度为1∶1000，底物显色时间为15min。该方法与CSFV、PRRSV、PPV、PCV2阳性血清不发生交叉反应，批内重复性试验和批间重复性试验的变异系数(CV)均小于10%