猪流行性腹泻病毒疫苗株在vero细胞中繁殖条件的优化

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1、当代畜禽养殖业ModernAnimalHusbandry科学研究组稿Email:nmgxmy2008@sina.com猪流行性腹泻病毒疫苗株在Vero细胞中繁殖条件的优化王琳邢育钢李继昌东北农业大学动物医学学院15003052摘要：通过研究猪流行性腹泻病毒（PEDV）疫苗NC1组、NC2组），每孔细胞密度约为4×10个/cm，株在Vero细胞中的繁殖规律，确定最佳的增殖条弃去培养基，用PBS缓冲液洗涤三次，以去除残留件。将猪流行性腹泻病毒疫苗株分别在六孔板、10L培养基。每孔加入200μL病毒液，5%CO2培养箱中转瓶

2、培养的Vero细胞中增殖试验，培养过程中检37°C吸附1h，弃去病毒液，补加维持液（不含血清的测不同接毒量及接毒后不同时间点病毒TCID50，DMEM培养基）2mL，胰酶浓度为5μg/mL，每板留以确定PEDV疫苗株的增殖规律。结果显示，在已一孔不接毒只更换维持液作为空白对照，接毒后置确定病毒增殖的最佳条件下，PEDV疫苗株在逐级于5%CO2培养箱中37°C进行培养，每隔12h观察放大的不同培养体系中均能获得较高而稳定的增细胞病变情况，同时收取每孔的细胞培养上清，3000殖，不同体系中病毒增殖均能达到106.3TCID5

3、0/rpm离心5min后放入-20°C保存，至接毒后72h。最0.1mL以上。后收取空白对照孔细胞培养上清，上清样冻融后，按关键词：猪流行性腹泻病毒；Vero培养；疫苗照Reed-Muench法计算TCID／0.1mL。本实验对猪流行性腹泻病毒疫苗株在Vero细TPCK胰酶浓度对病毒在Vero细胞中增殖的胞中的增殖规律进行了进一步探索，以获得该疫苗影响。按照1.4步骤中摸索的初步条件，分别在接毒株增殖的最佳条件，从而为猪流行性腹泻病毒细胞后加入TPCK-胰酶终浓度为1μg/mL、2μg/mL、5μg疫苗的研究奠定基础。/

4、mL、7.5μg/mL、10μg/mL和不加胰酶6组接毒试1材料与方法验，每组做2组平行。比较各组结果，以确定TPCK-（1）毒株。猪流行性腹泻病毒疫苗株（CV777）胰酶对病毒在Vero细胞中增殖的最佳浓度。8由本单位提供。病毒粒子浓度为5×l0PFU/mL。接毒量对病毒在Vero细胞中增殖的影响。在（2）主要试剂。DMEM培养基购自Gibco公司，最佳TPCK胰酶浓度条件下，分为4个不同接毒剂8进口胎牛血清购自Hyclone，胰酶购自Washington量组，分别病毒粒子浓度为5×10PFU/mL的病毒，公司。MOI

5、分别为1、0.1、0.01、0.001每个接毒剂量设置2（3）细胞及传代培养。Vero细胞来自哈尔滨兽个平行对照组，设1组只更换维持液无病毒的空白医研究所，在本实验室已扩增冻存，目前在本实验对照，比较各组结果，以确定最佳接毒剂量。室传至130代，已经适应在本实验室的培养基中生（5）PEDV在10L转瓶中增殖试验。根据在6长。满瓶的Vero细胞用0.25%胰酶-EDTA消化脱孔板中探索的最优条件，接毒后10L转瓶的维持液壁后，用10%DMEM培养基（含10%进口胎牛血体积为1000mL。共接毒3个10L转瓶，接毒后每隔5清

6、）终止消化并稀释到2～3×10个/mL，在10L转瓶12h收取细胞培养上清，3000rpm离心5min后放2（内壁表面积约为4000cm)中加入培养基1000mL，入-25℃保存，直至接毒后72h，上清样品冻融后，按42细胞重新贴壁以后密度约为5～6×10个/cm，在照按Reed-Muench法计算TCID／0.1mL。37℃恒温中，转瓶机釆用12转/h培养72h，细胞长2结果52成单层以后密度约为4×l0个/cm，用于接毒或2.1六孔板病毒增殖试验结果传代。（1）细胞病变情况。接毒后每隔12h观察细胞（4）PEDV在六

7、孔板培养体系中的繁殖试验。取病变，发现接毒后18h少数细胞病变，24h后细胞长满Vero细胞的六孔板（每孔直径为3.5cm，表面出现明显病变，细胞肿胀变圆，折光性增加，颗粒2积为9.5cm)两块（做两组平行对照，分别标记为物质增多，培养后期出现细胞脱落。2014.113科学研究HusbandryAnimalModern业殖养禽畜代当组稿Email:nmgxmy2008@sina.com图3不同浓度胰酶条件下病毒增殖的TCID50检测结果图1接毒前后Vero细胞的形态观察2.2PEDV在10L转瓶中增殖试验结果（2）六孔

8、板中病毒增殖试验结果。接毒后采取的对3个10L转瓶中Vero细胞的接毒试验样品细胞培养上清进行毒价检测，结果见表1。在接毒后进行病毒效价检测，结果见图4。接毒后12h即可60h病毒增殖滴度达到峰值1×106.3TCID50/0.1mL，检测到病毒效价，随时间延长逐渐上升，在60h能空白对照无病变。峰值可维持12h、7