携带不同ORF3基因的猪流行性腹泻病毒的拯救及其在VERO细胞上的增殖特性研究

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1、上海海洋大学硕士学位论文学校代码：10264研究生学号：M150104112上海海洋大学硕士学位论文携带不同ORF3基因的猪流行性腹泻病毒的题目：拯救及其在VERO细胞上的增殖特性研究RescueofPorcineEpidemicDiarrheaVirusCarryingDifferentORF3GenesandStudy英文题目：ofTheirProliferationCharacteristicsonVEROCells专业：临床兽医学研究方向：动物病毒学姓名：胡晓霞指导教师：李震二O一八年五月上海海洋大学硕士学位论文上海海洋大学硕士学

2、位论文上海海洋大学硕士学位论文答辩委员会成员名单姓名工作单位职称备注李家乐上海海洋大学教授主席张德福上海市农业科学院研究员委员刘惠莉上海市农业科学院研究员委员郑洪建上海市农业科学院研究员委员蒋杰贤上海市农业科学院研究员委员范晓芬上海市农业科学院助理研究员秘书上海市农业科学院答辩地点华漕院区机关二楼答辩日期2018.5.25会议室上海海洋大学硕士学位论文携带不同ORF3基因的猪流行性腹泻病毒的拯救及其在VERO细胞上的增殖特性研究摘要猪流行性腹泻（Porcineepidemicdiarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcinee

3、pidemicdiarrheavirus，PEDV）感染猪而引起的一种急性肠道传染病，常导致病猪水样腹泻、呕吐、脱水。自2010年起，其大规模的爆发给养猪业造成巨大的经济损失。PEDV属冠状病毒科α冠状病毒属，其基因组为单股正链RNA，编码非结构蛋白1A/1B和结构蛋白S、E、M、N。Orf3是位于PEDVs基因和e基因之间的第三阅读框，是目前发现的PEDV的唯一一个附属基因，编码ORF3蛋白，有关其功能是PEDV的研究热点之一。兽医界普遍认为其与PEDV的毒力相关，但在现有的研究中，受研究手段的限制，对其生物学作用和机理还了解不多。本研

4、究的研究内容及结果如下：（1）3株重组病毒的拯救及鉴定。通过构建带有不同orf3基因及orf3基因缺失的重组质粒，利用基于RNA同源重组的PEDV反向遗传学操作系统拯救3株携带有不同orf3基因及orf3基因缺失的重组PEDV，终末稀释法纯化病毒，并经RT-PCR法和免疫组化对获得的重I上海海洋大学硕士学位论文组病毒进行鉴定。RT-PCR结果及细胞病变观察证明成功拯救到了携带不同orf3基因及orf3基因缺失的重组PEDV；进一步的免疫组化分析结果证实重组PEDV的ORF3蛋白存在于其感染的Vero细胞中。（2）病毒生长曲线的绘制。将获得

5、的重组PEDV及实验室已保attwt存的重组病毒rDR13-ORF3和DR13弱毒株以MOI=0.1感染Vero细胞，分别于感染的第8、16、24、32、40、48h后，反复冻融3次，测定其TCID50并绘制以病毒感染时间为横坐标，TCID50为纵坐标的病毒生长曲线。测得的TCID50经SPSS分析表明携带有orf3基因的PEDV滴度（TCID50）显著高于缺失orf3基因的重组PEDV（p＜0.05）。（3）5株病毒感染细胞不同时间测定残留细胞数量。方法一：全自动细胞计数分析仪计数。将获得的重组PEDV及实attwt验室已保存的重组病毒

6、rDR13-ORF3和DR13弱毒株以MOI=0.1感染Vero细胞，分别在感染25和36h利用全自动细胞计数分析仪对感染后的残留活细胞进行计数。结果表明携带有orf3基因的PEDV感染Vero细胞25和36h时测的活细胞数显著高于缺失orf3基因的重组PEDV（p＜0.05）。方法二：CCK-8试剂盒测定病毒感染后残留活细胞数量。将获得attwt的重组PEDV及实验室已保存的重组病毒rDR13-ORF3和DR13弱毒株以MOI=0.1感染Vero细胞，并于感染后的第12、24、36、48h测定病毒感染后Vero细胞OD450值。SPSS

7、分析表明，病毒感染Vero细胞12h时，5株病毒感染的Vero细胞OD450值差异并不显著；病毒II上海海洋大学硕士学位论文感染24和48h后带有orf3基因的重组病毒活细胞OD450值显著高于orf3基因缺失的重组PEDV（p＜0.05），而在病毒感染36h后结果相似，但差异达极显著（p＜0.01）。此结果进一步验证了细胞计数仪检测的结果。（4）细胞活性的测定。将获得的重组PEDV及实验室已保存的attwt重组病毒rDR13-ORF3和DR13弱毒株以MOI=0.1感染Vero细胞，并于感染后的第12、24、36、48h测定病毒感染后V

8、ero细胞OD450值。根据细胞活力计算公式将测得的OD450计算为细胞活力，其结果经SPSS分析显示，病毒感染Vero细胞12h时，5株病毒感染的Vero细胞活性差异并不显著，感染24、48