CD26_DPP4对猪流行性腹泻病毒在Vero细胞中复制的影响

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1、分类号：Q81;S852.61单位代码：10183研究生学号：2016884004密级：公开吉林大学硕士学位论文（专业学位）CD26/DPP4对猪流行性腹泻病毒在Vero细胞中复制的影响EffectofCD26/DPP4onReplicationofPorcineEpidemicDiarrheaVirusinVeroCells作者姓名：曲佳丽类别：工程硕士领域（方向）：基因表达与调控指导教师：张明军教授培养单位：动物科学学院年6月CD26/DPP4对猪流行性腹泻病毒在Vero细胞中复制的影响EffectofCD26/DPP4onReplicationofPorcineEpidemicD

2、iarrheaVirusinVeroCells作者姓名：曲佳丽领域（方向）：基因表达与调控指导教师：张明军教授类别：工程硕士答辩日期：2018年06月04日中文摘要CD26/DPP4对猪流行性腹泻病毒在Vero细胞中复制的影响猪流行性腹泻病毒（Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）是引起猪流行性腹泻病（Porcineepidemicdiarrhea，PED）的病原体，PEDV的感染会导致严重的腹泻、呕吐和脱水，造成极高的死亡率，给养猪行业带来巨大经济损失和危害。为了更好地预防和控制PEDV的流行，最有效的方式就是在易感物种中接种疫苗，开发有效疫苗的关键是对

3、病毒入侵、病毒在细胞中复制等病毒感染过程的研究。病毒感染宿主细胞的过程包括病毒吸附并与宿主细胞表面受体结合、病毒脱壳和病毒基因组复制、核衣壳与病毒基因组的组装、宿主细胞溶解并释放出病毒等。由于PEDV还存在许多变种以及地方性流行毒株，为控制和预防PEDV的流行增加许多困难，因此开发出高效的疫苗和抗病毒药物对养猪行业意义重大。CD26/DPP4是一种丝氨酸蛋白酶，广泛分布于各种组织和细胞中，具有多种生物学功能。CD26/DPP4不仅与糖尿病和心血管疾病相关，还被发现作为中东呼吸综合征冠状病毒（MiddleEastrespiratorysyndromecoronavirus，MERS-Co

4、V）的细胞表面受体。MERS-CoV与PEDV同属冠状病毒属，并且有研究表明丝氨酸蛋白酶家族中的跨膜丝氨酸蛋白酶2（Transmembraneproteaseserine2，TMPRSS2）和跨膜丝氨酸蛋白酶13（Mosaicserineproteaselarge-form，TMPRSS13/MSPL）可以促进PEDV在Vero细胞中的复制，并促进病毒-细胞融合、细胞-细胞融合，这在病毒的感染中发挥了重要作用[1]。CD26/DPP4在Vero细胞中表达，并且Vero细胞是培养PEDV的常用细胞系。因此本实验通过使用CRISPR/Cas9（Clusteredregularlyinter

5、spacedshortpalindromicrepeats/CRISPR-associatednuclease9，CRISPR-Cas9）技术在CD26/DPP4第2外显子设计sgRNA，将单链sgRNA退火聚合成双链的gDNA，再将gDNA连接到pX330载体上，连接gDNA前还需用限制性内切酶BbSⅠ将pX330载体线性化，以此构建CD26/DPP4sgRNA表达载体。通过电击转染的方法将CD26/DPP4sgRNA表达载体转染到Vero细胞，经过筛选获得单克隆细胞。通过PCR鉴定，本实验共获得26I个阳性克隆细胞，选择Vero-KO-DPP4-1、Vero-KO-DPP4-12、

6、Vero-KO-DPP4-34、Vero-KO-DPP4-58四种阳性克隆以及Vero-KO-DPP4-24/25两种杂合克隆细胞，以Vero细胞为对照通过WesternBlot检测CD26/DPP4蛋白质的表达情况，发现阳性克隆细胞的CD26/DPP4蛋白质表达水平低于Vero细胞，其中Vero-KO-DPP4-34号阳性克隆明显低于Vero细胞。PEDV感染克隆细胞后，通过检测病毒拷贝数、病毒滴度和间接免疫荧光（indirectimmunofluorescence，IFA）检测PEDV复制水平发现，Vero-KO-DPP4-34克隆细胞中的PEDV复制水平低于Vero细胞中的病毒复

7、制水平，但病毒仍然可以感染克隆细胞，推测可能是由于CD26/DPP4并非是PEDV入侵Vero细胞唯一受体。通过检测克隆细胞的细胞增殖能力和细胞凋亡发现，4株阳性克隆细胞的增殖能力明显低于Vero细胞，但在细胞凋亡检测中只有Vero-KO-DPP4-34细胞的凋亡情况与Vero细胞有差异。因此本实验旨在通过CRISPR/Cas9技术对Vero细胞的CD26/DPP4基因进行敲除，在获得CD26/DPP4基因敲除型Vero细胞后，检测PEDV在克