稳定表达西尼罗病毒prm-e蛋白细胞系的构建

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1、:聲：'丨身:密级:论文编号:中囯农业科学院学位论文稳定表达西尼罗病毒prM-E蛋白细胞系的构建Z.''-、，'，•、，、、、••“、••''•••A一，，•’’_•^GenerationandCharacterizationofAMammalianCellLineContinuauslyExpressingprM-EProteinOfWNV硕士研宄生：郭立平指导教师：华荣虹副研宄员>：•;；.>'/'_：申请学位类别：农学硕士专i:'业：预辦暇学研宄方向：兽培养单位：哈尔滨兽医研究所研究生院2015年3月密级:论文编号:中国农业科学院学位论文稳定表达西尼罗病毒prM-E蛋白

2、细胞系的构建GenerationandCharacterizationofAMammalianCellLineContinuouslyExpressingprM-EProteinOfWNV硕士研究生：郭立平指导教师：华荣虹副研究员申请学位类别：农学硕士专业：预防兽医学研究方向：兽医微生物及其分子生物学培养单位：哈尔滨兽医研究所研究生院2015年3月Secrecy:No.ChineseAcademyofAgriculturalSciencesDissertationGenerationandCharacterizationofAMammalianCellLineContinuo

3、uslyExpressingprM-EProteinOfWNVM.S.Candidate：GuoLi-pingSupervisor：AssociateProf.HuaRong-hongMajor：VeterinaryMicrobiologyandMolecularBiologySpecialty：VeterinaryMedicineMarch2015独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证书而

4、使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。关于论文使用授权的声明本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，艮卩：中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。导师签名:时间：厂月II摘要西尼罗病毒（WestNileVirus，WNV）属黄病毒科，黄病毒属，是一种重要的人兽共患传染病病毒。多种鸟类和哺乳动物对该病毒易感，其中马受WNV的危害最为严重。人感染该病

5、毒后可导致西尼罗热，严重者出现中枢神经系统疾病，甚至可致死亡。该病毒对养殖业和人类健康都构成了巨大威胁。WNV尚无特异性的治疗方法，疫苗免疫接种是控制该病的主要措施。目前国外已经报道了几种兽用WNV疫苗，我国尚且没有可用的WNV疫苗。传统减毒活疫苗和灭活疫苗免疫原性比较好，但仍存在缺陷，如灭活苗免产生疫应答较慢，只能诱导低水平体液免疫，弱毒疫苗具有有潜在性安全问题等，因此研究者们致力于研发更为安全有效的新型疫苗。研究表明WNVprM-E蛋白能够在哺乳动物细胞中表达，并自我组装成病毒样颗粒（VLPs）。该病毒样颗粒与天然的病毒颗粒在诱导机体免疫应答方面有着相似的能力。本实验室在

6、之前的研究中已经利用哺乳动物表达系统成功表达了流行性乙型脑炎病毒（JEV）病毒样颗粒。因此，本实验拟构建一个能够持续稳定表达WNVVLPs的真核细胞系，为后续制备WNV亚单位疫苗奠定基础。为鉴定细胞系表达目的蛋白情况，本实验制备并筛选了一株WNVprM蛋白特异性单克隆抗体。该单抗细胞上清和腹水ELISA效价分别为1:2048和1:409600以上；单抗亚型鉴定结果表明10F7属于IgG2a，其轻链类型为κ链；Westernblot和IPMA结果显示，该单抗与WNVprM特异性反应，与JEV无交叉反应。将编码WNVprM蛋白和E蛋白基因的重组质粒pCAG-opti-WNV-pr

7、ME转染进BHK-21细胞，然后用含有G418的选择性培养基培养，经多次亚克隆并结合间接免疫荧光（IFA）和抗原捕获ELISA方法筛选，最终得到一个能够稳定表达WNVprM-E蛋白的细胞系W-92。IFA和流式细胞术试验结果表明该细胞系持续到第30代仍然保持高水平的蛋白表达。对W-92细胞系表达产物分离纯化后电镜观察，结果表明prM蛋白可与E蛋白组装成病毒样颗粒。将该病毒样颗粒抗原免疫小鼠后，可检测到较高效价的ELISA抗体；诱导的抗体具有病毒中和作用，对WNV的中和抗体效价为1：40，对JEV的中和效