人mchr2真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立

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1、人MCHR2真核表达载体的构建及稳定转染细胞系的建立　　【Abstract】AIM:Toconstructtheeukaryoticexpressionvectorofhumanmelaninconcentratinghormonereceptor2(MCHR2)andstablytransfectHEK293cellsentplifiedbyPCRfromthehumanfetalbraincDNAlibraryandidine.AfterscreeningculturebyG418,astablytransfe

2、ctedcelllinemunofluorescenceassay.RESULTS:TheeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1MCHR2entofthestablytransfectedcelllineandtheexpressionofthetargetgeneprovideasolidexperimentalfoundationforfurtherstudiesonthefunctionoftheMCHR2gene.　　【Keyelaninconcentratinghormone

3、,MCH)进入人们的视野.现已发现其有2种受体亚型，即MCHR1和MCHR2均属于G蛋白偶联受体家族.通过构建转基因和基因敲除动物模型已对MCH及MCHR1与肥胖及能量代谢的关系进行了深入细致的研究，但有关MCHR2的功能至今仍不十分清楚.为此我们构建了人MCHR2基因的真核表达载体，并转染HEK293细胞，建立了稳定表达MCHR2的细胞系，为深入研究MCHR2的生物学功能奠定实验基础.　　1材料和方法　　1.1材料人胎脑cDNA文库购自Clontech公司.菌株E.coliDH5α，质粒pcDNA3.1(+)和H

4、EK293细胞由本教研室保存.RTPCR试剂盒(TOYOBO公司)；TaqDNA聚合酶，T4DNA连接酶，限制性内切酶(EcoRI，XhoI)等工具酶(TaKaRa公司)；凝胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒(Qiagen公司)；脂质体LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)；G418(Amresco公司)；总RNA抽提液TriPure(Roche公司)；MCHR2抗体(SantaCruz公司);HRP标记的兔抗羊IgG和FITC标记的兔抗羊IgG(北京鼎国生物技术有限公司).　　1.2方法　　

5、1.2.1引物设计与合成根据GenBank登录的人MCHR2基因的序列（序列号为：AY562946）设计引物.上游引物为：5′ccggaattcACCATGAATCCATTTCATGCATCTTG3′；下游引物为：5′ccgctcgagATGGTGATCCATGTACTTTCCTAA3′.其中分别在上游和下游引物的5′端加上了EcoRI和XhoI的酶切位点和3个保护碱基，并且在起始密码前添加了Kozak序列，引物由TaKaRa公司合成.　　1.2.2人MCHR2全长cDNA的获取以人胎脑cDNA文库为模板，采用PC

6、R的方式扩增人MCHR2cDNA的编码区，全长为1023bp.PCR50μL反应体系中加入cDNA模板2μL，10×PCRBuffer5μL，MgCl23μL，2.5mmol/LdNTPMix4μL，20μmol/L上下游引物各1μL,，Taq酶0.5μL，加水至50μL.反应条件：94℃5min；94℃60s，57℃50s，72℃70s，35个循环；72℃7min.PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳分离鉴定.　　1.2.3人MCHR2真核表达载体的构建将上述PCR产物和pcDNA3.1(+)质粒分别用限制性内切

7、酶EcoRI和XhoI酶切后，10g/L琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收纯化，经T4DNA连接酶连接后转化E.coliDH5α感受态，氨苄青霉素筛选，挑取阳性克隆进行酶切和PCR鉴定，阳性克隆的质粒DNA经测序分析后证实并命名为pcDNA3.1MCHR2.　　1.2.4建立稳定转染人MCHR2的HEK293细胞系HEK293细胞在含100mL/L小牛血清的DMEM/F12培养基中，于37℃，50mL/LCO2的饱和湿度下培养.待细胞融合至70%~80％时按照LipofeetamineTM2000操作说明书进行空质粒pcD

8、NA3.1(+)和重组质粒pcDNA3.1MCHR2的转染.转染48h后，用胰蛋白酶消化细胞，在含有G418(700mg/L)的选择性培养基中加压筛选约4~6mol/LdNTP2μL，RNAase抑制剂1μL，MMLV逆转录酶1μL，加水补足至20μL，混匀，30℃10min，42℃20min，99℃5min终止反应.以GAPDH（450bp）为内参进行PC