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《STARD7真核表达载体的构建及肝癌细胞HepG1-2稳定转染株的建立及鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、STARD7真核表达载体的构建及肝癌细胞HepGl*2稳定转染株的建立及鉴定【关键词】STARD7;载体构建;转染SATRD7是一编码295个氨基酸残基，分子量为34.7kDa的新型蛋白质，其生物学功能至今未明。通过生物信息学分析，发现其全长序列中含有一个类固醇敏感性调节蛋白(StAR)相关脂类转运体结构域(START)oSTART涉及脂类结合介导的细胞信号转导、脂类转运和调节。START发生突变或错误表达与基I大I错配、自身免疫性疾病以及肿瘤相关。为了研究STARD7基因过表达后对肿瘤细胞生物学的影响,我们将STARD7基因克隆构建到真核表达载体上,并稳定
2、转染到HEPGP2肝癌细胞中。1.材料和方法1」材料:大肠杆菌DH-5a和人肝癌细胞系HepGl*2均由本实验室保存,pMD18-T载体购口大连宝生物工程有限公司,M-MLV逆转录酶购口Promega公司，各种分子克隆工具酶购自MBI公司，脂质体Lipofectamine2000>Trizol试齐！J、G418和pcDNA3」(・)真核表达载体购自Invitrogen公司,RPMI1640、胎牛血清(FBS)等购自GIBCOBRL公司。1.2方法。121HcpGl*2总RNA的提取。按照Trizol试剂说明书步骤提取总RNA。收集所培养的HcpGl*2,加T
3、RIZOL试齐I」ImL,静置3〜5min。加入氯仿0.5ml,混匀。室温静置2〜3min后,12000r/min离心15mino于上清中加人0.5ml异丙醇，室温静置lOmino10000r/min离心lOmin。弃上清，加入750ml/L乙醇lml,7500r/min离心5min,干燥沉淀，加入30pLDEPC处理水。经琼脂糖凝胶电泳显示无降解后，用紫外分光光度计测定其纯度并定量，保存于・80°C备用。1.2.2引物设计。根据GenBank的基因序列(NM_064536),设计扩增STARD7编码区cDNA上、下游引物。上、下游引物中分别引入Sami.X
4、hol酶切位点，扩增片段为880bpo上游5’CTCGAGATGGCGGCGTTAGCC3；下游5,CCCGGGAGCATACTCAATC3：内参照p-actin的引物序列为：上游59TGTGACGTGGACATCCGCAAAG3；下游5'TGGAAGGTGGACAGCGAGGC3；扩增片段为206bpo并设计作为转染HepGl*2细胞后鉴定用的G418抗性基因PGKneo的特界性弓I物:上游5FGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTG3下游5-AAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCG3：扩增片段为492bp。所有引物
5、均由Invitrogen公司合成。1.2.3逆转录合成cDNA逆转录。反应体系为：细胞总RNA1
6、ig,H2O13
7、iL,oligdT0.5
8、ig,70°C5min,立刻冰上放置，加入M-MLV200u,dNTP1Onmol,5xM-MLVBuffer5pL,RecombinantRNasinRibonucleaseInhibitor25u,混匀后42°Clh,70°ClOmino取lOpL反传录产物进行PCR反应，采用降落PCR(Touchdown_PCR),反应条件:94°C预变性4min;94°C变性30s,63°C退火30s,72°C延伸40s护增3
9、5个循环,72°C延伸7min。PCR产物经15g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定后，切胶回收目的片段。1.2.4T载体克隆。对PCR产物进行割胶纯化,将目的片段与pMD18-T载体连接。连接反应体系为:SolutionI5
10、iL,pMD18-TDNA50ng,PCR产物50ng,ddH2O3pL,置于16°C2h后，连接产物转化大肠杆菌DH-5a感受态，在氨节青霉素抗性平板上筛选生长，挑取单克隆菌落。阳性克隆经酶切鉴定，并命名为:pMD18-T/STARD7o1.2.5真核表达载体pcDNA3.1(・)/STARD7的构建用SamkXhoI分别双酶切重组pMD18-
11、T/STARD7质粒及pcDNA3.1(-)空载体，凝胶电泳后冋收口的片段,16°C连接10ho连接、转化，方法同前。阳性克隆经酶切鉴定后测序(Invitrogen公司)。测序止确后扩大培养,抽提重组质粒DNAo1.2.6细胞培养。HepGl*2细胞在含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液屮，于3TC、50mL/LCO2饱和湿度的孵箱屮培养。1.2.7HepGl*2细胞的基因转染和筛选培养。将处于对数生长期的HepGl*2细胞以4x105个细胞/孔接种于六孔板屮，培养24h,使细胞达到80%〜90%融合。用脂质体Lipofectamine2000介
12、导空质粒及重组质粒转染细胞。转染前lh先予细胞更换无
