stim1-shrna真核表达载体的构建及稳定低表达stim1 sgc7901细胞系的建立

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1、学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得直昌太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名(手写)：嗽签字日期：归D年6月g日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据

2、库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所和中国学术期刊(光盘版)电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名(矧：咖导师签名(矧：秭仍签字日期：扣哆年6月g日签字日期：沙侈年毛月旷日摘要mIIILIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIJllllLIIlY2427622目的：利用RNA干扰(RNAinterference)技术，构建针对STIMl基因的短发夹环状小干扰RNA(sho

3、rthairpinRNA，shRNA)真核表达载体，并将其稳定转染人胃癌细胞株SGC7901(HumanGastriccarcinomacelllineSGC7901)，建立STIMl稳定表达细胞株，为进一步研究STIMl基因在胃癌发生发展中的功能作用奠定坚实的基础。方法：利用GenBank数据库检索STIMl基因的核苷酸序列，根据shRNA设计原则，设计并合成3段特异性的小干扰片段，1段阴性对照组，将其定向克隆到载体pGPU6／GFP／Neo中重组构建RNA干扰质粒，并对重组载体测序鉴定。通过阳离子脂质体介导重组载体转染SGC7901细胞后，采用Westernblot检测筛选出沉默效率

4、最高的重组载体，同时利用G418抗性筛选，建立稳定STIMl低表达的人胃癌细胞SGC7901系。结果：经测序分析证实，靶向STIMl基因的3个pGPU6／GFP／Neo．shRNA重组载体构建成功，分别命名为pGPU6／shSTIMl．1，2，3，阴性对照组命名为pGPU6／shSTIMl．NC。Westernblot检测结果显示pGPU6／shSTIMl．3可显著抑制SGC7901细胞中STIMl蛋白的表达，干扰效率达82％左右。稳定转染pGPU6／shSTIMl．3质粒的细胞经G418(500I-tg／m1)筛选后，得到阳性克隆命名为SGC7901／pGPU6／shSTIMl细胞株。

5、经传代10次以上后，Westernblot检测结果显示干扰效率达81％。结论：成功构建了针对STIMl基因的shRNA真核表达载体，并建立了稳定转染STIMl基因的人胃癌细胞SGC7901系，为进一步研究STIMl基因的功能奠定了良好的实验基础。关键词：STIMl；胃癌细胞；RNAi；短发夹RNAAbstractABSTRACTobjective：ThisstudyistoconstructashorthairpinRNA(shRNA)eukaryoticexpressionvectortargetingtheSTIM1genesbyRNAinterference(RNAi)andtoe

6、stablishanstableHumanGastriccarcinomacelllineSGC7901expressingtherecombinantvectorsforSTIM1，ForthefurtherstudyofSTIM1genefunctionandgastriccancermetastasismechanismlayasolidfoundation．Methods：ThenucleotidesequencesofSTIM1geneswereretrievedfromGenbank．AccordingtotheguidelinesforshRNAdesign，threepa

7、irsofDNAsequencestargetingtheSTIM1genesandonecontrolgroupweredesignedandsynthesized．ThesynthesizedsequenceswereclonedintopGPU6／GFP／Neovectorandsequencinganalysis．Afterthat，therecombinantvectorsweretransfectedintoSGC790