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《稳定表达T7RNAP的BHK_21细胞系的建立》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、第32卷第6期中国预防兽医学报Vol.32，No.62010年6月ChineseJournalofPreventiveVeterinaryMedicineJun.2010稳定表达T7RNAP的BHK-21细胞系的建立1,2111112*11*李欣，杨少华，王洪梅，刘晓，武建明，高运东，王立群，仲跻峰，何洪彬(1.山东省农业科学院奶牛研究中心，山东济南250100；2.东北农业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨150030)摘要：为建立能稳定表达T7RNA聚合酶(T7RNAP)的BHK-21细胞系以研究RNA重组
2、疫苗，本研究从BL21(DE3)大肠杆菌中扩增T7RNAP基因，定向克隆于质粒pcDNA3.1(+)中，经双酶切及测序鉴定，获得阳性重组质粒pcDNA3.1-T7RNAP。用该质粒转染BHK-21细胞，经G418筛选14d后获得阳性细胞株。RT-PCR和westernblot检测结果表明，建立了稳定表达T7RNAP的BHK-21细胞系，并且在不同代次的阳性细胞中能稳定表达目的基因和蛋白，该研究为RNA病毒感染性质粒在细胞内转录及病毒拯救技术平台的建立奠定了基础。关键词：T7RNAP；BHK-21细胞中图分类
3、号：Q814文献标识码：A文章编号：1008-0589(2010)06-0473-03EstablishmentofBHK-21celllinesstablyexpressingT7RNAP1,211111LIXin,YANGShao-hua,WANGHong-mei,LIUXiao,WUJian-ming,GAOYun-dong,2*11*WANGLi-qun,ZHONGJi-feng,HEHong-bin(1.TheResearchCenterofDairyCow,ShandongAcademyofAg
4、ricultralScience,Jinan250100,China;2.CollegeofLifeScience,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030,China)Abstract:ToestablishthecelllinewithstableexpressionofT7RNApolymerasegene,T7RNAPgenewasamplifiedfromE.coliBL21(DE3)andinsertedintopcDNA3.1(+)vectort
5、oconstructrecombinantplasmidpcDNA-T7RNAP.TheBHK-21celllinestablyexpressingT7RNAPwasgeneratedbypcDNA-T7RNAPtransfectionandthepositivecellcloneswereobtainedaftercontinuallyscreeningusingG418.TheexpressionsofT7RNAPgenewereconfirmedbyRT-PCRandwesternblot.Thece
6、lllinestablyexpressingtheT7RNAPgenecouldprovideaplatformforrescueRNArecombinantvirusinvitroviareversegenetictechnique.Keywords:T7RNAP;BHK-21stablecelllines;reversegenetictechniqueT7RNA聚合酶(T7RNApolymeraseenzyme，本研究利用基因克隆及重组技术，构建了T7T7RNAP)是一种依赖DNA的RNA聚合酶，其编码
7、RNAP重组pcDNA3.1(+)质粒，转染BHK-21细胞[1]基因长度为2652bp。该酶是1个单体酶，可特异后，经G418筛选，获得了具有G418抗性的性识别T7启动子，在没有其它蛋白因子的协助下，BHK-21细胞系；经RT-PCR及WB检测表明，[2-5]就能介导T7噬菌体晚期基因转录的顺利进行。G418抗性的BHK-21细胞可稳定表达T7RNAPT7RNAP和相应转录单元在体内发生转录，以实现mRNA及蛋白。该细胞系为依靠T7RNAP体内转录[6-8]病毒的体内拯救。系统建立的RNA病毒反向遗传技
8、术平台提供了技*Correspondingauthor收稿日期：2009-10-12基金项目：国家转基因重大专项(2009ZX08007-006B)；山东省自然科学基金(Y2008D20)；山东农科院“杰出人才”基金；山东省农业重大应用技术创新课题；山东省科技攻关项目作者简介：李欣(1982-)，女，黑龙江牡丹江人，硕士研究生，主要从事微生物学研究.*通信作者：E-mail：wangliqun2@163.com；
