稳定表达t7+rna聚合酶的st细胞系的建立

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1、新疆农业大学硕士学位论文稳定表达T7RNA聚合酶的ST细胞系的建立姓名：祁巧芬申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：仇华吉;冉多良20080601摘要ST细胞系(猪睾丸细胞系)是猪瘟病毒等猪源病毒的敏感细胞系，常用于猪瘟病毒的分离培养和体外增殖。本研究旨在构建稳定表达T7RNA聚合酶的猪睾丸细胞系(ST细胞系)，用于猪瘟病毒等的反向遗传操作。采用PCR方法，以BHK肿细胞基因组为模板扩增T7RNA聚合酶基因，将其定向插入到真核表达载体plRES2．EGFP中，得到plRES2．EGFP-T7，用脂质体法转染ST细胞，通过(3418筛选和单细

2、胞克隆化，同时用RT-PCR及T7启动子控制下的红色荧光蛋白的表达载体瞬时转染，检测T7RNA聚合酶的表达，经过15次传代后能检测到T7RNA聚合酶的稳定表达，建立了稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系ST厂r7，为猪瘟病毒等的反向遗传操作技术提供了研究工具。关键词：T7RNA聚合酶；ST细胞；稳定细胞系AbstractSTcellline，awell—establishedcelllinederivedfromswinetesticles，isamongseveralcelltypespermissivetoCSFV(includingmostwi

3、ld—typeandseveralvaccinestrains)．STceusarealsosusceptivetosomeotherswineviruses．ThusSTcellsareusuallyusedtoisolateandpropagatetheseviruses．ThisstudywasaimedtoestablishaST-basedcelllinestablyexpressingtheT7RNApolymerase，whichcanbeusedinthereversegeneticmanipulationofCSFVandoth

4、erswineRNAviruses．Tothisend，atri-cistronexpressionplasmidcontainingT7RNApolymerasegene，enhancedgreenfluorescentprotein(EGFP)gene，andneomycinresistancegenewasconstructed．Co-transfectionofST(swinetesticle)cellswiththerecombinantresultingplasmidandanotherrecombinantplasmidcontai

5、ningredfluorescentprotein(RED)geneunderthecontrolofT7promoterresultedinefficientREDexpression．Astablecellline，designatedasSⅥ7，wasscreenedfromSTcellstransfectedwiththetri-cistronexpressionplasmidwiththeaidoftheEGFPreporterandG418resistance，andshowntoexpressT7RNApolymeraseeffic

6、ientlyandstably，asdemonstratedbytransienttransfectionofthestablecelllineofdifferentpassageswiththeREDgene—containingplasmid．ThestableexpressioncelllinecanbeusedtorescuevirusfromclonedeDNAofsomeporcineRNAviruses．Keywords：T7RNApolymerase,STcells；stablecelllinesII独创性声明本人声明所呈交的论文

7、是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特,另ODi：l以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得新疆农业大学或其他教育单位的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：彳’f1，弓t7"1时间：喈年多月f／日关于学位论文使用授权的说明本人完全了解新疆农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：新疆农业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编

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