猪瘟病毒HLLY地方株E2基因在毕赤酵母中的表达及高效表达条件的探索

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1、东北农业大学硕士学位论文猪瘟病毒HL-LY地方株E2基因在毕赤酵母中的表达及高效表达条件的探索姓名：满朝来申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：李一经2003.5.1摘要猪癔楚危害葬猪韭的主要传染癀，为了得到大鬣的猪瘟瘸毒特异慌诊断抗原，并试闰在真拔细胞中犬量表达猪瘟病毒特有的免疫保护性抗原，即E2囊膜糖蛋白．为进一步铡釜猿癌亚摹挺疫茁有效蘸茨本痰羹定綦鹚。搴试验善次毙爨7我黧遗方分裹株HL，LYE2囊膜糖蛋白基因，将该基因整合到肇赤酵母袭达系统，使该基因获得了高效表达，并在此基础上探索了不同外界条件对表达量的影响。／主要结果如下：摄瓣基鑫瘁蠢发表鲍猪瘟

2、褒毒糙基因謦列及孥券酵母表达载钵pPIC9静多竞隆位点序列，利用Oligo和Primer5．0簿软件设计并合成～对引物，以提取猪瘟病毒HL．LY株总RNA为模扳，应用RT．PcR技术，扩增锝到E2基因。将该基因片段兜嵬隆到pMm8-T载律上．并避章予了酶弼、PCR鉴定和溪l痒努析，阳性重维菔粒命名为下．E2。运用DNAMAN软件将测序结果岛国内外已发表的猪瘟病毒Alfort株，Brescia株，SHIMEN拣，C拣，C—V—LZ拣，GS—LT檬翻GS—LX拣静E2基嚣垒缪列和E2基因主要抗原睡序列(23bp--545bp)的核营酸和羝基酸序，《进行了黼源性比较

3、，E2蒸因全序列核苷酸的同源性分别为：99．20％，95．44％，96．51％，95．53％，89．12％，78．66％，78。23％主要挠蒙区棱蜚酸豹曩滚性分裂为；98+90％，95。05％，96。70％，96，15％，95．42％，82．42％，83．15％。E2基因全序列氨基酸的同源性分别为：98．93％，95．98％，97．32％，95．71％，89．54％。83．16％，83．42％；主鬻抗原区氨基酸的间源性分别为：98．35％，95．05％，97．25％，95．60％，95。05％+87，36％，88。弱％。结繁袭明E2基因主要抗原区和全序列均具有

4、较高的保守性，与国内外代表毒株Alfort株，Brescia株，SHIMEN株，C拣同源性较赢，瓣与国内其他毒株C。V-LZ株，GS—LT棣，GS．LX株同源健较低，说晴我国都分选区猪瘟病毒存在E2基因突变棒。将重组质粒T-E2的E2基因酶切后，溉克隆到袭达载体pPIC9上，经酶切和PCR鉴定，愈名为pPIC9一E2。重组表达载髂pPIC9．E2缀SalI酶切线性纯嚣，电转纯整台到毕赤酵母GSll5基因组上，经PCR鉴定和PCR产物测穿分析，阳性转化予命名为GSll5·pPIC9-E2·将GSl15一pPIC9-E2在30℃条锌下振荡培养，疆1％夔攀醇诱导，猿

5、瘟痪毒我融合蛋白获得了表达，表达量为o．349／L。表达产物经SDS．PAGE和Westem．blot和Dot．ELISA分析，确定其表达的融合骚自分子擞太小为50．54ku，且具有天然蛋白的抗原特异惶。通过对表达条件如pH值、通气量、诱导甲醇终浓度、培养基的选择等条件的探索，可确定猪瘟筑毒HL*LY拣嚣2基因表达豹理想条{孛为：最适pH馕在4．0-6。0之闯，最遁培养萋为MM培养基，最佳诱导的甲酵终浓度为1％，加大道气量时表达量较妣∥％：’关键词猪瘟病毒：E2基因；(克隆；表达：毕赤酵母。，一。。，；—一!一。。——当型喹篁篁鹜鲨鎏圣一．。。。。。．一，。。

6、，。Expression程嚣2GenefromClassicalSwineFeverVirusHL-LYIsolateinPichiapastorisandExploringforItsExpressionConditionsAbstractClassicalSwineFever(CSF)isoneofmajorcontagiousdiseasesinpigbreedingindustryInordertogainmassivediagnosticantigenCSFV，andlargescaleofCSFVspecificmajorprotectiveant

7、igenprotein(E2envolopeglycoproteimineucaryoticcells，whicharepreparedintosubunitvaccineforeffectiveproventionagainstCSF．E2genefromCSFVHL-LYisolatewasclonedandexpressedinPichiaPastorisexpressionsystem，moreovef'conditionswereexplorerdforexpressingtheE2envelopeglycoprotein．Theresultsmsh

8、owedasfollows．Accor