登革2型病毒样颗粒在毕赤酵母中的表达和免疫学初步研究

《登革2型病毒样颗粒在毕赤酵母中的表达和免疫学初步研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、中山大学博士学位论文登革2型病毒样颗粒在毕赤酵母中的表达和免疫学初步研究姓名：刘文权申请学位级别：博士专业：微生物学指导教师：江丽芳20090604中山大学博士学位论文登革2型病毒样颗粒在毕赤酵母中的表达和免疫学研究心颗粒。由于VLPs保留了与天然病毒粒子类似的空间构型和诱导中和抗体的抗原表位，因此VLPs不但能诱导产生体液免疫，而且可以激发CD4+T细胞的增殖和CTL反应(cytotoxicTlymphocyte)。VLPs被认为是预防黄病毒感染的有效的、潜在的亚单位疫苗候选。目的：利用含GAP(glyceraldehyde．3．phosph

2、atedehydrogenase)启动子的毕赤酵母组成性表达系统表达编码DENV-2prM和E蛋白的融合基因，在成功获得DENV-2VLPs的同时实现VLPs在该系统中的连续和高效表达。最后对VLPs的免疫原性和免疫保护性进行研究，为开发四价的DENV病毒样颗粒疫苗奠定基础。方法：首先，通过分子遗传进化分析选择具有代表性的DENV-2流行株作为研发颗粒疫苗的候选株；利用RT-PCR的方法从病毒上清中扩增DENV-2的prM和E基因；设计并构建含全长的E蛋白的prME与含截去E蛋白TM2跨膜域的prME472，分析TM2的缺失对E蛋白分泌水平和V

3、LPs组装的影响；利用在prM的N末端分别引入PrM信号肽和0L信号肽以探索VLPs的高水平分泌表达。然后，将构建好的重组载体转化大肠杆菌，经PCR、酶切和测序鉴定正确后，将重组载体转化毕赤酵母；将PCR鉴定正确的酵母克隆进行发酵表达；将发酵上清和细胞裂解液分别进行SDS．PAGE和Westernblotting检测；并分析目的蛋白的连续性表达情况；利用发酵上清进行血凝实验检测VLPs的分泌情况；利用蔗糖梯度离心的方法从细胞裂解液中分离纯化细胞内的VLPs(IntracellularVLPs)，利用超滤浓缩的方法纯化上清的VLPs(Secret

4、edVLPs)。通过电子显微镜技术检测VLPs的结构以及在细胞内的组装特征。最后，将纯化到的VLPs免疫BALB／c小鼠，通过ELISA测定血清中特异性抗体的滴度；利用免疫荧光技术和体外中和试验检测VLPs的免疫反应性和中和抗体的滴度；对免疫鼠进行攻毒实验，评价VLPs能否诱导免疫记忆。结果：1．分子遗传进化分析结果表明，本实验室分离的DENV-2ZSOI／01株在进化树上与广东省2001株的DENV-2流行株，以及菲律宾1998．2001年的DENV-2Il中山大学博士学位论文登革2型病毒样颗粒在毕赤酵母中的表达和免疫学研究流行株比邻，在基因

5、分型上都属于全球流行(Cosmopolitan)基因型。因此，选取DENV-2ZSOI／01株作为DENV-2病毒颗粒疫苗的候选株具有广泛的代表性。2．本研究成功构建了以下3种重组表达质粒，包括：含prM信号肽和全长E蛋白的pGAPA—SprME；含prM信号肽和截去E蛋白TM2端的pGAPA．SprME472；含Gt信号肽和全长E蛋白的pGAPaA-prME；并将重组质粒成功转化毕赤酵母X33，获得了重组表达克隆。3．通过SDS—PAGE和Westernblotting检测发现E蛋白分别在含prM信号肽和a信号肽的引导下分泌到上清中。prM信

6、号肽的分泌效率高于q信号肽。同时，与全长的E蛋白相比，缺失TM2端的E蛋白的分泌水平并不没有得到明显的提高。研究结果还表明含GAP启动子的组成性表达系统能连续性和高效表达E蛋白。4．在含prM信号肽重组子的表达上清中检测到了血凝活性。说明prM信号肽能有效的引导VLPs分泌到上清。且TM2端的缺失不会影响病毒颗粒的组装。5．通过蔗糖密度梯度离心，分离到了大小分别为30nm和55nm的DENVVLPs。并通过透射电镜观察，发现这两种VLPs在酵母细胞内的组装特征与DENV病毒感染细胞中类似。6．通过免疫电镜观察，在含prM信号肽的重组子的发酵上清

7、浓缩液中检测到了30nlTl的VLPs，说明VLPs可以被prM信号肽有效的引导分泌到上清中。7．ELISA检测抗体滴度表明VLPs能诱导小鼠体内产生了高水平的的特异性抗体，最高滴度达到了1：10000。免疫荧光结果表明将VLPs免疫血清稀释1280倍后，仍在DENV-2感染的C6／36细胞浆内检测到了强烈的荧光信号。8．体外中和试验表明，VLPs免疫血清能有效的中和DEM，-2NGC株对C6／36细胞的感染，中和滴度与灭活的DENV-2免疫血清相同，均为1：45。攻毒后VLPs免疫鼠的中和抗体滴度有了很大的提升，达到了1：100。免疫结果提示

8、VLPs能诱导BALB／c鼠产生免疫记忆反应。III中山大学博士学位论文登革2型病毒样颗粒在毕赤酵母中的表达和免疫学研究结论：1．DENV-2ZSOI