拟态弧菌外膜蛋白OmpU基因的克隆表达及其免疫保护性研究

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1、中文摘要拟态弧菌(Vibriomimicus)是危害水产动物的重要病原菌之一，不仅可引起鱼蟹类严重的腹水病，而且还可通过水产动物和水产品感染人类，引起腹泻和食物中毒。腹水病是我省鱼蟹类养殖中常见的疫病之一，控制腹水病的发生和蔓延已成为水产养殖业持续发展的关键。细菌外膜蛋白黏附素黏附定植于宿主组织细胞表面是细菌感染的重要初始环节，否则细菌就不能在局部定居，继而产生毒素或侵入深部组织，引起感染发生。研制以抗黏附作用为主的外膜蛋白疫苗已成为免疫防治细菌感染最有效的措施之一。为此，本课题以拟态弧菌外膜蛋

2、白OmpU为靶蛋白，在对ompU克隆表达的基础上研究融合重组蛋白的抗原性和免疫保护性，旨在为研制OmpU基因工程疫苗奠定了基础。首先，对拟态弧菌安徽分离株进行ompUPCR扩增、克隆测序和生物信息学分析。研究中根据霍乱弧菌参考株ompU全序列，设计合成2对分别针对ompU部分序列和全序列的特异性引物，以拟态弧菌基因组DNA为模板，PCR扩增ompU，构建重组质粒pMDl8-T-OmpU，筛选阳性重组克隆进行序列测定和生物信息学分析。结果显示：4株拟态弧菌安徽分离株均携带ompU，ompU片段长为

3、849bp，该基因片段的核苷酸同源性在拟态弧菌安徽分离株之间以及与霍乱弧菌参考株之间均较高，分别介于94．2％～100％和83．4％～87．6％之间。拟态弧菌HX4菌株ompUORF长1038bp，编码346个氨基酸，OmpU相对分子量为36．95kDa，其N端前22个氨基酸组成信号肽，N末端氨基酸序列与流感嗜血杆菌HMW黏附素序列具有相似性，在5觚～21aa和201aa～218a砣间有两个明显跨膜域，其二级结构以a．螺旋和B．折叠为主，间或有13转角和无规卷曲，DNAstar软件预测出在Omp

4、U的20aa-34aa、36aa-67aa、73aa-81aa、88aa-112aa、123aa-134aa、143aa．160aa、164aa-174aa、177aa-200aa、217aa-227aa、244aa-259aa、275aa-288aa、295aa-303aa和314aa-340aa之间存在抗原表位。表明拟态弧菌OmpU是一种具有较好保守性和抗原性的黏附素孔蛋白。其次，构建重组质粒pGEx．4T-l—OmpU并进行原核表达。研究中重新设计l对包含BamHI和髓锨I酶切位点的引物，

5、扩增ompU全序列，构建重组表达质粒pGEX-4T-OmpU并转化至EcoliBL21(DE3)感受态细胞进行原核表达、产物鉴定和可溶性分析。结果显示重组表达质粒经IPTG诱导培养4h后，能在E．coliBL21中表达分子量约为62．9kDa的融合蛋白GST-OmpU。表明ompU得到了良好的融合表达。最后，采用免疫印迹和免疫保护性试验测定融合蛋白GST-OmpU的抗原性和免疫保护性。研究中将纯化的Omps、GST．OmpU以及诱导表达菌裂解液经SDS．PAGE电泳后转印至PVDF膜进行West

6、ernblot检测。同时以融合蛋白GST-OmpU免疫接AbstractVibriomimicusisoneofthemainpathogenicbacteriathatharmaquaeanimals．ItnotonlyleadstoscriousasciticfluiddiseaseoffishandEriocheirsinensis，butalsocauseshumandiarrheaandfoodtoxicosisthroughaquaticaninlalsandaquaticprodu

7、cts．AsciticfluiddiseaseisoneofcommonepidemicdiseasesinfishandEriocheirsinensiscultivationinAnhuiprovince．Controllingoccunenccandspreadofasciticfluiddiseasehasbecomethekeytosustainabledevelopmentofaquaculture．Bacterialadhesiontohostcellssurfacebyouter

8、membraneproteinisanimportantelementarystepofinitialinginfection，otherwisebacteriacannotstaythere，producetoxinorpenetratedeepertissueandcauseinfection．ExploitingoutermembraneproteinvaccinewithantiadhesionisoneofthemosteffectivemeaslesfortheimmBnepreve