钩端螺旋体外膜脂蛋白loa22的克隆、表达与免疫保护性的研究

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1、主要缩略语英文索引缩略语全称中文名称AA/aaaminoacid氨基酸A450absorbanceat450nm450nm处吸光度BLASTbasiclocalalignmentsearchtool基本局部相似性比对搜索工具Bpbasepair碱基对BSAbovineserumalbumin牛血清白蛋白Mrrelativemoleculemass相对分子质量dNTPdeoxynucldeosidetriphosphate脱氧三磷酸核苷酸PCRpolymerasechainreaction聚合酶链反应DMEMdulbecco´smodifiedeaglemedium达尔伯氏改良

2、培养基DTTdithiothreitol二硫苏糖醇ELISAenzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验EMJHellinghausen-McCullough-Johnson-HarrisEMJH培养基IPTGisopropythio-β-D-galactoside异丙基-β-D-硫代半乳糖苷ODopticaldensity光密度PAGEpolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳SIstimilationindex刺激指数TBStris-bufferedsalineTris缓冲盐溶液DMSOdimethy

3、lslfoxide二甲基亚砜Tristris-(hydroxymethyl)aminomethane三羟甲基氨基甲烷EDTAethylenediamietetraaceticacid乙二胺四乙酸HRPhorseradishperoxidase辣根过氧化物酶LBluria-bertanibrothLB培养基SDSsodiumdodecylsulphate十二烷基硫酸钠HEhematoxylinandeosin苏木素-伊红KD/kDakilodalton千道尔顿rpmrevolutionsperminute每分钟转数PBSphosophatebufferedsalin磷酸盐缓冲液

4、1钩端螺旋体外膜脂蛋白Loa22的克隆、表达及免疫保护性研究研究生：张连英导师：谭立志教授中文摘要目的：构建钩端螺旋体外膜脂蛋白Loa22基因的原核表达载体pQE31－Loa22，并在大肠杆菌M15中诱导表达目的蛋白。Loa22蛋白免疫豚鼠，研究其在豚鼠体内产生的的体液免疫和细胞免疫应答水平，并通过体内外试验检测其免疫保护性，为研制钩端螺旋体疫苗奠定实验基础。方法：以赖型钩端螺旋体56601株基因组为模板，聚合酶链反应(PCR)扩增大小为516bp的目的基因片段。Loa22基因克隆至原核表达载体，构建pQE31-Loa22。重组质粒双酶切和测序鉴定。重组质粒转化入大肠杆菌M1

5、5中诱导表达目的蛋白。SDS-PAGE、Western-blot鉴定目的蛋白。于0w、2w、4w将蛋白及对照PBS分别经豚鼠腹股沟、腋下、背部多处免疫豚鼠。末次免疫后2w，用培养7d的56601株钩端螺旋体从腹腔攻击各免疫组豚鼠(1mL/只)。连续观察15天，观察各免疫组豚鼠发病情况，并取各免疫组豚鼠的肺、肝、肾做病理切片，HE染色观察比较各免疫组豚鼠的组织病理变化。分析蛋白Loa22对豚鼠的免疫保护作用。ELISA法测定各免疫组豚鼠血清中抗体水平。无菌分离豚鼠脾淋巴细胞，MTT比色法检测各免疫组豚鼠脾淋巴细胞的体外增殖反应，计算刺激指数。ELISA测定Loa22蛋白抗血清与

6、致病性钩端螺旋体56607、56603、56609株的交叉免疫反应。通过Fontana镀银染色法检测Loa22蛋白抗血清对钩端螺旋体56601株黏附Raw264.7细胞的阻断情况。结果：PCR扩增出为516bp的目的片段。重组质粒经测序和双酶切鉴定构建成功。重组质粒转化入M15后，SDS-PAGE、Western-blot检测目的基因能表达Mr为22KD的蛋白。豚鼠接种Loa22蛋白后产生了特异性抗体，末次免疫后2w豚鼠血清抗体最高滴度均达到了1：8000，而接种PBS的豚鼠血清中无特异性抗体。蛋白免疫组豚鼠脾淋巴细胞在体外经蛋白刺激后刺激指数（3.25±0.37）明显高于P

7、BS对照组（1.38±0.13）。Loa22蛋白免疫的豚鼠用56601株钩体攻击，经实验观察无发病现象，HE染色显示各组织没有病理改变。而PBS免疫的豚鼠在实验中不同程度的出现2食欲不振、活动减少等现象，HE染色显示各组织均有明显的病理改变。Loa22蛋白抗血清与致病性钩体56607、56603和56609株具有良好的交叉免疫反应（效价为1/409600、1/819200、1/3376800）。Loa22蛋白抗血清稀释比率为1:50时黏附抑制率为90%，稀释比率为1:400时黏附抑制率为50％。结论：(