赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体的构建及表达的初步研究

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1、赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体的构建及表达的初步研究作者：黄毕,鲍朗*,钟琪,商正玲,张会东,张英【摘要】　　目的:构建赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体并在COS7细胞中表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的研究和开发奠定基础。方法:从赖型钩端螺旋体017株全基因组中PCR扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒pcDNA3.1LipL32。脂质体转染法将重组质粒转染COS7细胞,通过RTPCR、Westernblot检测目的基因的表达。结果:成功构建了LipL32基因的真核表达载体,并在COS7细胞中获得瞬时和稳定表达。结论:

2、赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体能在哺乳动物细胞内表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的应用提供了实验依据。【关键词】钩端螺旋体外膜蛋白LipL32真核表达　　由致病性钩端螺旋体所引起的钩端螺旋体病（简称钩体病）是一种世界范围内广泛分布的人兽共患自然疫源性疾病,严重危害人类健康和农牧业生产[1]。我国是钩端螺旋体病高发国家,遍布三十多个省、市、自治区。近几十年来已有数次大规模的流行,对我国农牧业生产和农民身体健康造成极大危害。尽管近年来钩端螺旋体病总体发病率和死亡率有所降低,但是一旦自然条件发生变化（如洪灾、13地震等）,极有可能造成局部或全面爆发流行

3、。加上近年来流行菌群的更迭,缺乏敏感的早期诊断方法和广谱高效的疫苗,钩端螺旋体病仍然严重威胁着我国人民尤其是农民的健康。钩端螺旋体菌型复杂,仅致病性钩端螺旋体就有23个血清群、200个以上的血清型,我国至少可以确定有26个国际新血清型,是世界上血清群型最多的国家。而目前广泛使用的钩端螺旋体灭活疫苗诱导的免疫保护不完全,保护时间短,菌型间交叉免疫保护性弱。因此,开发广谱、高效、持久的新型疫苗势在必行。本研究室率先在国内外进行钩端螺旋体DNA疫苗的研究,曾将钩端螺旋体内鞭毛蛋白基因制备DNA疫苗,免疫动物后发现该DNA疫苗具有明显的免疫保护作用[2]。LipL32是

4、钩端螺旋体含量最多的外膜蛋白,在钩端螺旋体的致病、免疫保护过程中可能起着十分重要的作用[3]。本研究即以赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因为目的基因,构建其真核表达载体并转染哺乳动物细胞,旨在为钩端螺旋体DNA疫苗的研究和开发奠定基础。　　1材料和方法　　1.1材料钩端螺旋体017株,本研究室常规保种并定时感染豚鼠传代以保持毒力。真核表达质粒pcDNA3.1、宿主菌E.coliDH5α、COS7细胞本研究室保存。PCR试剂盒购于TaKaRa公司;限制性核酸内切酶、DNA连接试剂盒及反转录试剂盒为晶美公司产品;脂质体转染试剂、TRIzol购自Invitrog

5、en公司;DNA提取试剂盒、13胶回收试剂盒、细胞可溶性蛋白提取试剂盒、6×His单克隆抗体（mAb）、DAB显色液购自Tiangen公司;βactin多克隆抗体购于精博生物技术公司;二抗（羊抗鼠IgGHRP及羊抗兔IgGHRP）为北京中衫公司产品;其余试剂均为国产或进口分装（分析纯）。　　1.2方法　　1.2.1钩端螺旋体017株基因组的提取参照Terpstra等[4]方法并略加修改。　　1.2.2LipL32基因PCR扩增根据GenBank数据库中LipL32基因的序列设计引物,上游和下游分别引入KpnI和EcoRI的酶切序列。P1:5′CGGGTA

6、CCGAAGGAGAGTCTATGAAAAAAC3′,P2:5′GCTGCCGCCACCGCCGGATCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCCCGGAATTCCTTAGTCGCGTCAGAAGC3′（划线部分分别是KpnI和EcoRI酶切位点）（Invitrogen公司合成）。PCR反应体系:按TaKaRa公司PrimerSTARTMHSDNAPolymerase使用说明书操作。以赖型钩端螺旋体017株基因组为模板,P1、P2为引物,98℃变性10s,55℃退火5s,72℃90s,30个循化。取PCR产物进行80g/L琼脂糖凝胶电泳,胶回收

7、试剂盒回收目的基因。　　1.2.3重组载体的构建和鉴定将载体pcDNA3.1、13LipL32基因分别用KpnI和EcoRI限制性核酸内切酶双酶切后,胶回收目的基因。按连接试剂盒说明书16℃连接4h。转化宿主菌E.coliDH5α,挑取阳性克隆摇菌、提取质粒进行双酶切、PCR鉴定,同时将重组载体送Invitrogen公司测序。空载体pcDNA3.1转化E.coliDH5α方法同上。　　1.2.4转染质粒的提取分别挑取重组成功的单克隆菌落和空载体菌落于10mLLB培养基中37℃振荡培养过夜（Amp50mg/L）,次日提取质粒,电泳鉴定及紫外分光光度法测定质粒的纯度

8、和浓度,-20℃备用。