浅谈赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体的构建及表达的初步研究

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1、浅谈赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体的构建及表达的初步研究【摘要】　　目的:构建赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体并在COS7细胞中表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的研究和开发奠定基础。方法:从赖型钩端螺旋体017株全基因组中PCR扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒LipL32。脂质体转染法将重组质粒转染COS7细胞,通过RTPCR、Westernblot检测目的基因的表达。结果:成功构建了LipL32基因的真核表达载体,并在COS7细胞中获得瞬时和稳定表达。结论:赖型钩端螺旋体外膜

2、蛋白LipL32基因真核表达载体能在哺乳动物细胞内表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的应用提供了实验依据。【关键词】钩端螺旋体外膜蛋白LipL3真核表达由致病性钩端螺旋体所引起的钩端螺旋体病是一种世界范围内广泛分布的人兽共患自然疫源性疾病,严重危害人类健康和农牧业生产[1]。我国是钩端螺旋体病高发国家,遍布三十多个省、市、自治区。近几十年来已有数次大规模的流行,对我国农牧业生产和农民身体健康造成极大危害。尽管近年来钩端螺旋体病总体发病率和死亡率有所降低,但是一旦自然条件发生变化,极有可能造成局部或全面爆发流行。加上近年来流行菌群

3、的更迭,缺乏敏感的早期诊断方法和广谱高效的疫苗,钩端螺旋体病仍然严重威胁着我国人民尤其是农民的健康。钩端螺旋体菌型复杂,仅致病性钩端螺旋体就有23个血清群、00个以上的血清型,我国至少可以确定有26个国际新血清型,是世界上血清群型最多的国家。而目前广泛使用的钩端螺旋体灭活疫苗诱导的免疫保护不完全,保护时间短,菌型间交叉免疫保护性弱。因此,开发广谱、高效、持久的新型疫苗势在必行。本研究室率先在国内外进行钩端螺旋体DNA疫苗的研究,曾将钩端螺旋体内鞭毛蛋白基因制备DNA疫苗,免疫动物后发现该DNA疫苗具有明显的免疫保护作用[2

4、]。LipL32是钩端螺旋体含量最多的外膜蛋白,在钩端螺旋体的致病、免疫保护过程中可能起着十分重要的作用[3]。本研究即以赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因为目的基因,构建其真核表达载体并转染哺乳动物细胞,旨在为钩端螺旋体DNA疫苗的研究和开发奠定基础。1材料和方法材料钩端螺旋体017株,本研究室常规保种并定时感染豚鼠传代以保持毒力。真核表达质粒、宿主菌DH5α、COS7细胞本研究室保存。PCR试剂盒购于TaKaRa公司;限制性核酸内切酶、DNA连接试剂盒及反转录试剂盒为晶美公司产品;脂质体转染试剂、TRIzol购自

5、Invitrogen公司;DNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、细胞可溶性蛋白提取试剂盒、×His单克隆抗体、DAB显色液购自Tiangen公司;βactin多克隆抗体购于精博生物技术公司;二抗为北京中衫公司产品;其余试剂均为国产或进口分装。方法钩端螺旋体017株基因组的提取参照Terpstra等[4]方法并略加修改。LipL32基因PCR扩增根据GenBank数据库中LipL32基因的序列设计引物,上游和下游分别引入KpnI和EcoRI的酶切序列。P1:′CGGGTACCGAAGGAGAGTCTATGAAAAAAC3′,

6、P2:′GCTGCCGCCACCGCCGGATCCGCCACCGCCGCTTCCACCGCCACCCCGGAATTCCTTAGTCGCGTCAGAAGC3′。PCR反应体系:按TaKaRa公司PrimerSTARTMHSDNAPolymerase使用说明书操作。以赖型钩端螺旋体017株基因组为模板,P1、P2为引物,8℃变性10s,5℃退火s,2℃0s,0个循化。取PCR产物进行80g/L琼脂糖凝胶电泳,胶回收试剂盒回收目的基因。重组载体的构建和鉴定将载体、LipL32基因分别用KpnI和EcoRI限制性核酸内切酶双

7、酶切后,胶回收目的基因。按连接试剂盒说明书16℃连接h。转化宿主菌DH5α,挑取阳性克隆摇菌、提取质粒进行双酶切、PCR鉴定,同时将重组载体送Invitrogen公司测序。空载体转化DH5α方法同上。转染质粒的提取分别挑取重组成功的单克隆菌落和空载体菌落于10mLLB培养基中37℃振荡培养过夜,次日提取质粒,电泳鉴定及紫外分光光度法测定质粒的纯度和浓度,-20℃备用。COS7细胞的复苏和培养从液氮罐中取出细胞,迅速解冻,加到含100mL/L小牛血清RPMI1640培养液中。37℃、0mL/LCO2孵箱培养,待细胞生长达8

8、0%汇合时,以/L胰酶消化传代。COS7细胞的脂质体转染将对数期生长的COS7细胞按105个/孔接种至6孔板中,培养24～3h至细胞生长达80%汇合时转染。按LipofectamineTMXX说明书进行。分别用RPMI1640培养液稀释重组质粒LipL32、空载体和LipofectamineTMX