浅谈赖型钩端螺旋体外膜蛋白lipl32基因真核表达载体的构建及表达的初步研究

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1、浅谈赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体的构建及表达的初步研究【摘要】　　目的:构建赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体并在COS7细胞中表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的研究和开发奠定基础。方法:从赖型钩端螺旋体017株全基因组中PCR扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒pcDNA3.1LipL32。脂质体转染法将重组质粒转染COS7细胞,通过RTPCR、HSDNAPolymerase使用说明书操作。以赖型钩端螺旋体017株基因组为模板,P1、P2为引物,98℃变性10s,55℃

2、退火5s,72℃90s,30个循化。取PCR产物进行80g/L琼脂糖凝胶电泳,胶回收试剂盒回收目的基因。　　1.2.3重组载体的构建和鉴定将载体pcDNA3.1、LipL32基因分别用KpnI和EcoRI限制性核酸内切酶双酶切后,胶回收目的基因。按连接试剂盒说明书16℃连接4h。转化宿主菌E.coliDH5α,挑取阳性克隆摇菌、提取质粒进行双酶切、PCR鉴定,同时将重组载体送Invitrogen公司测序。空载体pcDNA3.1转化E.coliDH5α方法同上。　　1.2.4转染质粒的提取分别挑取重组成功的单克隆

3、菌落和空载体菌落于10mLLB培养基中37℃振荡培养过夜（Amp50mg/L）,次日提取质粒,电泳鉴定及紫外分光光度法测定质粒的纯度和浓度,-20℃备用。　　1.2.5COS7细胞的复苏和培养从液氮罐中取出细胞,迅速解冻,加到含100mL/L小牛血清RPMI1640培养液中。37℃、50mL/LCO2孵箱培养,待细胞生长达80%汇合时,以2.5g/L胰酶消化传代。　　1.2.6COS7细胞的脂质体转染将对数期生长的COS7细胞按105个/孔接种至6孔板中,培养24～36h至细胞生长达80%汇合时转染。按L

4、ipofectamineTM2000说明书进行。分别用RPMI1640培养液稀释重组质粒pcDNA3.1LipL32、空载体pcDNA3.1和LipofectamineTM2000脂质体。将脂质体和DNA混合后室温静置15min。转染细胞用无血清的RPMI1640培养液洗涤2次,然后逐滴加入所制备的脂质体DNA混合物。重组质粒转染组和空载体转染组分别转染6孔。留1孔仅加RPMI1640培养基作空白对照。37℃、50mL/LCO2孵箱中培养6h后弃转染液,加入2mL含100mL/L小牛血清的RPMI1640培养

5、液继续培养48h收获瞬时转染细胞。稳定转染细胞株的筛选参照2结果　　2.1赖型钩端螺旋体017株LipL32基因的PCR扩增扩增出一特异性条带,约810bp（图1）。　　图1钩端螺旋体017株LipL32基因的PCR扩增（略）　　Fig1PCRproductofLipL32amplifiedfromLeptospirastrain017genomicDNA　　M:DNAmarker;1:ProductforLipL32.　　2.2LipL32真核重组质粒的构建和鉴定挑取阳性克隆摇菌提取质粒经80g/L琼脂糖凝胶

6、电泳初步鉴定后,用KpnI和EcoRI双酶切鉴定并以提取质粒为模板,P1、P2为引物进行PCR扩增,空载体pcDNA3.1作对照。双酶切结果示该重组质粒含有一810bp左右的片段,PCR结果示该重组质粒能扩增出目的片段,而空载体pcDNA3.1未能扩增出,测序结果和GenBank中LipL32基因序列比对,100%匹配,表明重组质粒构建成功(图2)。　2.3转染质粒的提取琼脂糖电泳显示,大部分DNA呈超螺旋构型,DNAA260/280=1.8～1.9,适合转染。　　2.4脂质体DNACOS7细胞的瞬时转染和稳

7、定株的筛选由于脂质体对细胞有毒性,转染后细胞有部分形态皱缩或死亡,培养液中可见结构破坏后的碎点。加入高浓度的G418后,转染和未转染的细胞均出现大量皱缩变性细胞,至第5天未转染组细胞几乎全部死亡,质粒转染组尚有活细胞存在,降低G418浓度继续培养1周,得到稳定转染的细胞株。　　图2LipL32基因真核重组质粒的构建及鉴定（略）　　Fig2Constructionandidentificationoftheeukaryoticrebinantvector　　M:DNAmarker;1:PlasmidpcDNA3.

8、1;2:Rebinantplasmid(pcDNA3.1LipL32);3:PlasmidpcDNA3.1digestedid(pcDNA3.1LipL32)digestediddigestedplifiedfromrebinantvectorerP1andP2;7:PCRproductamplifiedfromplasmidpcDNA3.1.　　2.5质粒转染的COS7细胞RT