甲型流感病毒m2基因真核表达载体的构建及初步表达

《甲型流感病毒m2基因真核表达载体的构建及初步表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、甲型流感病毒M2基因真核表达载体的构建及初步表达作者：杨靖，张卫东，曹康，蒋中华，李虹，李明远[摘要]目的:构建含有甲型流感病毒M2基因的真核表达载体。体外转染真核细胞株HEK293细胞并检测目的蛋白的表达。方法:从接种人流感病毒株A/PR/8/34(H1N1)的鸡胚尿囊液中提取病毒RNA，用特异引物进行RT－PCR，扩增M2基因。通过分子克隆技术将所扩增片段插入真核表达质粒载体pcDNA3.1(+)。经酶切及PCR鉴定后用PolyFect脂质体将其转染到HEK293细胞中，通过免疫荧光技术鉴定其表达。结果:经双酶切、PCR及测序鉴定证实M2基

2、因的真核表达载体构建成功。免疫荧光技术证实流感病毒M2基因的表达。结论:甲型流感病毒M2蛋白是一种具有高保守性，可形成离子通道并影响流感病毒表面蛋白血凝素(HA)天然构象的形成，被认为是具有交叉免疫保护性的结构蛋白。甲型流感病毒M2基因真核表达质粒的构建及成功表达将为甲型流感病毒基因工程疫苗，通用疫苗和核酸疫苗的研究打下基础。　　[关键词]甲型流感病毒；M2基因；真核表达载体；免疫荧光技术　　Abstract:ObjectiveToconstructeukaryoticexpressionplasmidcontainingM2genefromi

3、nfluenzaAvirus,transferitintoHEK293eukaryoticcelllineanddetecttheexpressionoftargetprotEin.MethodsRNAallantoicfluidofchickenembryoinoculatedplifiedbyRT-PCRerandinsertedintotheeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1(+)forconstructingtherebinantplasmidpcDNA3.1(+)-M2.Thentherebinant

4、plasmideanalysis,PCRandsequencinganalysis.ResultsRestrictionenzymeidentification,PCRandsequencinganalysisdemonstratedthattheM2genemunofluorescenceassayconfirmedthattheM2genecouldbeexpressedinHEK293cells.ConclusionM2proteinofinfluenzaAvirusisakindofhighlyconservedproteininami

5、noacidsequenceanditsionchannelactivitycanaffectthestructuralstabilizationofhaemegglutinin(HA)ofinfluenzavirus.Sothestudyprovidesabasisforexploringgeicengineeredvaccine，DNAvaccineandbroad-spectrumvaccineforinfluenzaAvirus.　　Keymunofluorescenceassay　　1933年Smith等人首先用雪貂分离出甲型流感病毒

6、，确定了流感病毒的病因。自此，人类对流感病毒进行了大量的综合性科学研究，但流感的预防和控制从始至今是困扰人类的一个难题。甲型流感病毒广泛存在禽类和哺乳动物中,也是目前致人类和各种动物流感的主型，在人类和动物间流行时可导致高发病率和高死亡率[1]。流感病毒的分子结构和宿主界限有利于流感病毒的复发和疾病的流行，其表面的糖蛋白的高度变异更是导致疫苗免疫效果下降的主要原因[2]。核酸疫苗作为控制流感的新兴技术越来越受到重视，由于其能够同时刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，易于操作，经济有效，目前已成为疫苗研究的热点[3]。　　自甲型流感病毒发现以来，在检

7、测的毒株中，M2蛋白的基因序列同源性可达90%，未存在明显变异，尤其是N端的10个氨基酸在人流感病毒和禽流感病毒几乎完全相同[4]，这引起了研究人员的极大关注，并进一步研究M2蛋白能否产生交叉免疫引起广泛的抗甲型流感病毒的作用。因此，M2蛋白被认为是流感病毒疫苗可刺激机体产生交叉保护效果的极具潜能保护性抗原。本课题针对流感病毒M2基因进行克隆并构建真核表达载体pcDNA3.1(+)/M2。利用Polyfect转染HEK293细胞，借助免疫荧光技术鉴定其在体外细胞的表达，以便为今后进一步深入开展核酸疫苗的免疫效果、免疫机制和携带不同基因核酸疫苗的

8、联合应用奠定基础。　　1材料与方法　　1.1载体和细胞株　　真核表达载体pcDNA3.1(+)为Invitrogen公司产品。感受态大肠埃希菌JM10