流感病毒ha基因真核表达载体的构建及动物免疫试验研究

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1、万方数据ConstructionandAnimalImmunityTestsoflnfl。uenzaVirusHAinEukaryoticExpressionVectorThe"submittedt01lleslsSUbm]tt缸DAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomy一Author：LiuHuan(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine)Supe

2、rvisor：AssociateProf．HuangJuanProf．ShanHuDLLiGuimeiQingdao．ChinaJune，2014万方数据本研究受以下项目的支持：1、财政部中国亚太经合组织合作基金项目2、科技基础工作专项(2012FYlll000)3、青岛市科技计划基础研究项目(13⋯14213--jch)万方数据独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得青

3、岛农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生躲》IL嵌帆矽噼易月l弓日关于论文使用授权的说明本人完全了解青岛农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意青岛农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。(保密的学位论文在解密后应遵守此协议)研究生躲矛＼嫉帆加I炉幻啪导师签名：葭瓜帆加，丫年

4、易月B日万方数据青岛农业大学硕士学位论文摘要流感病毒HA基因真核表达载体的构建及动物免疫试验研究摘要流感(Influenza)，可引起急性高度传染性疾病，是目前危害世界公共安全的一种重要疫病。流感多次在世界上引起大流行，最严重一次是1918年的西班牙大流感，全球有2100万人感染并死亡，另外，2009年北美和墨西哥爆发的大型甲型H1N1流感及每年均会发生的季节性流感，均具有一些共同的特性：传染性强，传播范围广。2013年中国爆发新型H7N9流感，这也突显了流感病毒对人类造成的巨大危害。鉴于流感病毒的亚型多，变异快，研

5、究者们要定期更改疫苗株，不仅消耗大量的人力和物力，还存在新疫苗研制滞后于病毒变异这一重大问题。因此，研制一种能够应对流感病毒快速变异，并具有广泛保护作用的“通用型”疫苗具有重要的应用价值。研究者发现HA单体在翻译后会被宿主细胞内的蛋白裂解酶裂解成HAl和HA2两个亚单位，N端的HAl形成球状头部结构，具有很高的变异性，C端的HA2形成茎部结构，含有高度保守的融合序列。研究显示在小鼠和雪貂动物模型中，利用DNA疫苗免疫动物能产生针对HA茎部靶点即HA2部分的中和抗体，能够抵抗病毒感染，对不同亚型的致死剂量病毒(从194

6、3到2007多个不同的流行株)有交叉保护作用，以上的研究表明基于茎部HA2区域设计的通用疫苗可以对流感病毒感染提供广谱的免疫保护，可能是有潜力的通用疫苗候选靶点。本研究首先构建了A／PuertoRico／8／1934(H1N1)流感病毒HA基因及HAl部分和HA2部分的真核表达载体，对重组真核表达载体体外表达情况进行鉴定，进而对重组真核表达载体在小鼠体内免疫原性进行评估。试验一、流感病毒HA基因真核表达载体的构建本试验以A／Puertomco／8／1934(H1N1)流感病毒HA基因为模板，分别设计3对引物(下游引入

7、His标签)，扩增HA、HAl、HA2三个基因片段，插入ClaI／BgllI限制性酶切位点，并通过PCR、双酶切及序列测定进行鉴定。结果显示，重组质粒经PCR鉴定分别在1671bv、1005bp及690bp处扩增出目的条带，双酶切鉴定获得目的条带及4746bp的载体条带，经序列测定发现三种重组质粒与参考毒株CYl46833．1的序列同源性达到99％，表明重组质粒构建成功，并将其命名为pCAGGS．HA、pCAGGS．HAl、pCAGGS-HA2。试验二、重组真核表达载体体外表达与鉴定将pCAGGS．HA、pCAGGS

8、—HAl、pCAGGS．HA2真核表达载体瞬时转染至T万方数据青岛农业大学硕士学位论文摘要HEK．293T细胞，48h后进行PT-PCR检测及免疫荧光检测，结果显示，瞬时转染后的细胞通过RT-PCR试验，并经过琼脂糖凝胶电泳，在1671bp、1005bp及690bp处扩增出特异性条带，瞬时转染重组质粒的细胞出现绿色荧光，瞬时转染空载体的细胞无荧