钩端螺旋体黏附相关蛋白的研究

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1、IYIIIIIIl2LIIIIl4I!ILH4IIIH。7I㈣土厣文通戈訾1wIFl2118I。18117112117IIY2440710土厣文通戈訾wF2808727SHANGHAfJIAOTONGUNlVERSJTY博士学位DOCTORALDISSERTATl0N论文题目钩端螺旋体黏附相关蛋白的研究学科专业作者姓名指导教师答辩日期病原生物学陈春燕郭晓奎教授二。一二年五月上海交通大学2012届博士学位论文钩端螺旋体黏附相关蛋白的研究姓名：陈春燕学号：0087109006系所：医学院专业：病原生物学研究方向：细菌致病

2、机制学习年限：2006．9～2012．6学位级别：博士导师：郭晓奎教授导师组：秦金红副教授本课题受以下基金资助：国家自然科学基金(编号：81171587和30770111)二O一二年五月ThesisforDoctorDegree，ShanghaiJiaoTongUniversitySTUDIESONTHELEPTOSPIRAADHESIoNRELATEDPROTEINSPh．DCandidate：ChunyanChenCollege：SchoolofMedicineMajor：MedicalMicrobiologyR

3、esearchField：MechanismsofBacterialPathogenicityStudyperiod：2006．9-2012．6Advicer：Xiao。KuiGuoFUND：ThisworkwassupportedbythegrantsfromtheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No．81171587andNo．30770111)May，2012上海交通大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得

4、的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：豫各诲日期：小f2年，月哆日上海交通大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权上海交通大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复

5、制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在一年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保引。(请在以上方框内打“√”)学位论文作者签名：勺泵寿遵日期：Af>年r月≥弓日指导教师签名新比屯吼慨峭吒上海交通大学医学院2012届博士学位论文摘要钩端螺旋体病是由致病性钩体引起的全球分布的自然疫源性疾病。我国是受钩体病危害较为严重的国家之一。钩体致病机制目前仍不是很清楚，本研究主要从钩体黏附相关蛋白及钩体金黄地鼠非致死感染病模型两方面展开研究。黏附是钩端螺旋体致病的重要环节之一。本研究以问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株56601的全基

6、因组DNA构建噬菌体文库，成功构建了插入片段为500-2000bp的xgtll噬菌体展示文库。此钩体基因组文库的原始包装噬菌体的滴度为2．54x107，以覆盖到整个钩体全部ORFs99．9％计，覆盖钩体整个基因组ORFs500倍以上。以IPTG的诱导的全基因组文库与细胞外基质胶原蛋白I相互作用筛选黏附相关蛋白，经3轮扩增后PCR、测序，得到序列重复超过4次的候选基因16个。对其进行克隆表达，进一步验证蛋白与胶原蛋白I的黏附能力，筛选出LA3333的FG及RHS蛋白结构域具有结合胶原蛋白I的能力。生物信息学分析显示LA

7、3333具有信号肽，有3个跨膜结构，编码多个结构域，其中SpvB为类沙门菌毒力因子，FG及RHS均编码配体结合域。实验结果证明，LA3333在钩体体外培养及感染过程中均表达，且为钩体表面暴露蛋白。进一步研究LA3333(FG及RHS)与其他细胞外基质胶原蛋白Ⅳ、纤连蛋白及层黏连蛋白的结合能力。发现FG及RHS也能黏附纤连蛋白及层黏连蛋白，但不能黏附胶原蛋白Ⅳ。进而用特异性的抗体进行黏附抑制实验，表明RHS抗体可以特异性抑制RHS蛋白与胶原蛋白I、纤连蛋白及层黏连蛋白的结合，证实RHS蛋白与胶原蛋白I、纤连蛋白及层黏连

8、蛋白为特异性结合。FG抗体与正常小鼠血清都可以与胶原蛋白I、纤连蛋白及层黏连蛋白的结合，但两者无显著的统计学差异。提示FG蛋白可能与血清的某种未知成分结合，有待进一步的实验验证。以FG抗体及RHS抗体与钩体相互作用，比较作用后的钩体以及未作用的钩体与巨噬细胞的黏附能力。FG及RHS抗体可以降低钩体与巨噬细胞的黏附能力。进一步的实验还表明FG抗体