单纯疱疹病毒II型gD模拟抗原表位的筛选及分析

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1、单纯疱疹病毒II型gD模拟抗原表位的筛选及分析【摘要】目的：用抗HSV2gD单克隆抗体（mAb）从噬菌体随机12肽库中筛选HSV2gD抗原模拟表位序列.方法：利用HSV2gDMcAb淘筛噬菌体随机12肽库，经四轮富集筛选，随机挑取阳性克隆扩增后进行ELISA鉴定，同时提取其基因组DNA进行序列测定，并利用生物信息学软件对包膜糖蛋白Ｄ（gD）进行B细胞抗原表位分析.结果：经四轮生物淘筛后，特异性噬菌体克隆得到了富集.经过对阳性克隆携带的随机12肽序列进行综合生物信息学分析，得到了PYHH和PPLW两个模拟HSV2gD抗原表位的主要氨基酸基序.结论：用噬菌体

2、随机12肽库成功筛选到了两个模拟HSV2gD抗原表位的主要氨基酸基序，可模拟McAb针对的抗原表位，可能是HSV的替代抗原.该研究方法为研制更有效及更广谱的HSV基因疫苗提供了依据.【关键词】噬菌体随机肽库单纯疱疹病毒模拟表位0引言7单纯疱疹病毒（herpessimplexvirus，HSV)是世界范围内流行的疱疹性疾病的病原体［1］，现已发现的HSV包膜上的糖蛋白有11种，它们是HSV主要的免疫原，能诱导体液和细胞免疫，产生高滴度中和抗体，激发迟发型超敏反应（delayedtypehypersensitivity，DTH）及T细胞增殖反应，以HSV包膜糖蛋白Ｄ（g

3、lycoproteinD,gD）免疫作用最强［2］.gD是极为保守的免疫原性蛋白，其在病毒复制和刺激中和抗体的产生中起重要作用，也是宿主细胞免疫和体液免疫反应的主要靶标之一［3］.噬菌体展示技术（phagedisplay）是近年来发展的一项新的分子生物学技术，是研究抗原抗体相互作用的有力工具，可以从随机肽库中直接筛选能和抗体结合的模拟抗原表位，而这些表位不必预先确定蛋白质的氨基酸残基序列［4］.本研究利用抗HSV2gD单克隆抗体（mAb）从噬菌体肽库中筛选HSV2gD抗原模拟表位，为进一步研发防治HSV感染的新型疫苗奠定基础.1材料和方法1.1材料噬菌体随机12

4、肽库试剂盒，滴度为1.8×109pfu/μL(美国NEB公司)；特异性抗HSV2gDmAb，属于IgG1，M13DNA抽提试剂盒(北京博菲康生物技术有限公司)；E.coliER2738宿主菌，为F+，四环素抗性转基因组株(北京地坛医院传染病研究所提供)；其余试剂均由北京地坛医院传染病研究所提供.1.2方法1.2.1淘筛HSV2gD的模拟抗原表位第一轮淘筛时，取HSV2gDmAb包板，轻摇4℃过夜，弃去包被液，加满封闭液4℃4h，用洗涤液TBST（50mmol/LTrisHCl,150mmol/LNaCl,1mL/LTween20）快速洗板6次，取原噬菌体肽库

5、2.22μL（4×1010噬菌体）加入100μLTBST包被孔中，室温轻缓摇动60min，TBST洗涤去除未结合的噬菌体.用TBST洗涤10次，加入100μL非特异洗脱缓冲液（0.2mol/L的甘氨酸盐酸，1g/LBSA，pH2.2）轻摇10min，将洗脱物转入微量离心管中，加入15μL1mol/LTrisHCl（pH9.1）中和，取114μL洗脱液加入1∶100稀释的11mL的ER2738培养物中，37℃7振摇4.5h，扩增噬菌体.按相同的方法共进行四轮淘筛，在进行第四轮淘筛时，洗涤时提高吐温20（Tween20）的浓度至3mL/L.1.2.2阳性克隆鉴定随机挑

6、取第四轮筛选中得到的30个噬菌体克隆做双抗夹心ELISA检测，待检克隆与阴性对照吸光度值之比大于2.1判定为阳性.具体操作步骤严格按照《应用噬菌体表面展示肽库快速筛选肽配体》使用手册进行.1.2.3DNA序列测定用M13DNA抽提试剂盒（QIAprepM13Kit）提取噬菌体单链DNA，由北京奥珂测序公司测序.推导相应外源氨基酸序列，并进行同源性比较.1.2.4生物信息学分析把淘筛所得到的12肽序列融合入M13噬菌体的pIII序列内，处于开放阅读框（ORF）的第19到30个氨基酸位点，应用DNAStarProtean软件提供的模块进行表面可能性、亲水性和抗原指数的分析

7、，以此对两个可能的模拟抗原表位序列进行蛋白二级结构与B细胞抗原识别位点预测.2结果2.1肽库筛选共进行了四轮筛选.第一轮筛选投入量为4×1010pfu(噬斑形成单位)，产出量为2×103pfu；第二轮筛选投入量为1×1011pfu,产出量为2×104pfu；第三轮筛选投入量为1×1011pfu，产出量为5×106pfu；第四轮筛选投入量为2×1011pfu,产出量为2×105pfu.72.2ELISA检测结果通过双抗夹心ELISA法，共有11个克隆与阴性对照吸光度值之比大于2.1，为阳性克隆.阳性克隆率为37%.将此11个阳性克隆命名为P1～P11.