结核杆菌hsp16.3基因缺失突变株的构建及鉴定

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1、ConstructionandIdentificationofMycobacteriumtuberculosisstrainswithHsp16.3geneknock-outADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineByTIANXi-ze(Pathologyandpathophysiology)DissertationSupervisors:Prof.ZHANGWan-

2、jiangJune,2012石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名：时间：年月日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位

3、论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日摘要目的：构建及鉴定结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株Hsp16.3基因缺失突变株、结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株Hsp16.3基因缺失突变株和卡介苗菌株Hsp16.3基因缺失突变株。为进一步研究Hsp16.3基因的功能及探讨结核病的防治奠定基础。方法：培养结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株、结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株和卡介苗菌株，并提取结核分枝杆菌H37Rv

4、菌株基因组DNA。以结核杆菌H37Rv菌株基因组DNA为模板，分别扩增Hsp16.3基因两侧Rv2030c基因和acg基因中663bp和684bp的两个DNA片段，分别插入到pKO质粒载体预定位点中，并经过抗生素筛选，菌液PCR鉴定、质粒PCR鉴定、双酶切鉴定及测序等鉴定，构建结核分枝杆菌Hsp16.3基因打靶载体；进一步将结核分枝杆菌Hsp16.3基因打靶载体分别电转入结核分枝杆菌H37Rv菌株、结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株和卡介苗菌株内，并与各菌株基因组中的Hsp16.3基因发生同源重组，筛选结核分枝杆菌国际标准强毒株H37

5、Rv菌株Hsp16.3基因缺失突变株、结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株Hsp16.3基因缺失突变株和卡介苗菌株Hsp16.3基因缺失突变株。结果：1.分别扩增Hsp16.3基因两侧两DNA片段，经测序证实为所需目的片段。2.将两个目的片段插入到pKO质粒载体中，构建结核分枝杆菌Hsp16.3基因打靶载体，经PCR鉴定及测序表明两目的片段已插入pKO质粒预定位点。3.将结核分枝杆菌Hsp16.3基因打靶载体分别电转入结核分枝杆菌H37Rv菌株、结核分枝杆菌H37Ra菌株和卡介苗菌株中，经PCR、蔗糖及潮霉素筛选表明已构建出各结核杆菌菌

6、株Hsp16.3基因缺失突变株。结论：1.成功构建出结核分枝杆菌Hsp16.3基因打靶载体。2.成功构建结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv菌株Hsp16.3基因缺失突变株。3.成功构建结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌株Hsp16.3基因缺失突变株。4.成功构建出卡介苗菌株Hsp16.3基因缺失突变株。关键词：基因敲除，基因打靶载体，Hsp16.3，结核分枝杆菌，电转化研究类型：A（基础研究）IAbstractObjective:ToconstructandidentifythestrainsofMycobacteriumtuberc

7、ulosisH37RvandH37RaandMycobacteriumbovisBacilleCalmette-Guérin(BCG)withHsp16.3geneknock-out.ItprovidesidealfeasibletoolforthestudiesofHsp16.3genefunction.Methods:MycobacteriumtuberculosisstrainsH37RvandH37RaandMycobacteriumbovisBCGstrainwereculturedinvitro,andtheH37Rvgenom

8、eDNAwasextracted.InordertoobtainagenetargetingvectorpKO-Hsp16.3,twofragments(5’-Hsp16.3,3