细菌基因缺失株的构建方法.ppt

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1、学生：王薇指导教师：李槿年教授细菌基因缺失株的构建方法汇报提纲基本概念1.Red重组系统介绍2.重组自杀性质粒方法简介3.一、基本概念基因的同源重组（homologousrecombination），又叫基因打靶（genetargeting），是指外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组，并整合在预定的位置上，从而改变了细胞某些遗传特性的方法，重组的目的是为了敲除某个基因。背景利弊二、Red重组系统介绍组成原理Red重组系统1、背景二、Red重组系统介绍敲除细菌基因的传统方法是利用RecA重组系统。RecA重组系统是大肠杆菌内源性的同源重组体系，它由

2、RecA蛋白和RecBCD蛋白组成。这种方法需要较长的靶基因同源序列，还需构建具有靶位点的质粒，重组效率较低。近来由Murphy和Stewart等人用噬菌体的Red重组系统在大肠杆菌中建立的快速敲除原核基因的方法简化了实验操作，使实验周期大大缩短。这种重组技术是一项可在染色体水平上进行遗传操作的新技术，只需较短的同源序列，而不需要特定的限制性酶切位点，即可在生物体内完成重组过程，省去了体外DNA酶切、连接等步骤。2、组成二、Red重组系统介绍质粒pKD46：为同源重组的辅助质粒，含温度敏感型复制子，高于37℃该质粒会丢失，阿拉伯糖诱导后能够表达Gam、Beta和Ex

3、o3个λ噬菌体重组酶。2、组成二、Red重组系统介绍质粒pKD3：为PCR扩增提供氯霉素抗性基因的模板，氯霉素抗性基因两侧有FRT位点(FLP重组酶识别位点)，为重组转化子提供筛选标志。2、组成二、Red重组系统介绍质粒pCP20：是具有氨苄青霉素(Amp)抗性和氯霉素(Cm)抗性的质粒，含有温度敏感型复制子，能够表达FLP重组酶，42℃诱导下FLP重组酶得到表达，质粒也逐渐丢失，该质粒用于消除FRT位点间的cat基因。3、原理二、Red重组系统介绍HX4电转HX4扩增电转HX4HX4HX4HX44、利弊二、Red重组系统介绍以Red重组系统为基础的基因敲除是最近研

4、究较热的技术方法，对研究微生物基因的功能具有重要的促进作用。它与传统的基因敲除方法相比，重组效率明显提高，而且此方法利用线性打靶DNA，不需构建打靶质粒，因此实验周期大大缩短。但到目前为止，此系统还主要应用于大肠杆菌的基因整合和敲除，在其它菌株获得成功的实例较少，具体原因尚不明确。三、重组自杀性质粒方法简介自杀性质粒简介原理三、自杀质粒方法介绍构建含一定长度同源DNA片段的重组自杀质粒，利用宿主自身的重组系统与同源重组序列交换，而经两次重组过程最终完成重组。这种重组技术可直接对宿主染色体进行修饰，并在多种革兰氏阴性菌中得到应用。目前，高效自杀性载体系统和Red同源重

5、组系统均能够对革兰氏阴性菌染色体直接进行修饰，但Red同源重组系统将在染色体中残留FRT位点，而自杀性载体系统在染色体中除目的基因外，不保留任何外源DNA，利用该技术可以获得具有完全生物安全意义的重组疫苗株。1、简介自杀质粒：通常为R质粒的衍生质粒，具有接合转移基因。它的复制需要一种特殊的蛋白，大多数细菌不产生这种蛋白质，因此，当进入寄主细胞时，要么不能复制，被消除，要么被整合入染色体上，和染色体一起复制。利用自杀质粒的这个特点，将基因工程技术构建的基因缺失的DNA片断，克隆入自杀质粒，利用缺失基因两端的同源片断，定位自杀质粒的整合位点。利用同源性DNA片断可发生重

6、组的原理，构建精确基因缺失菌株。在多数情况下，利用自杀质粒，可随心所欲缺失大多数基因的任何部分。三、重组自杀性质粒方法简介2、原理三、重组自杀性质粒方法简介2、原理2、原理三、重组自杀性质粒方法简介OmpUOmpUOmpUpSKOmpUpREOmpUOmpUHX4（pREOmpU）OmpUOmpUThankYou!