牛种布鲁氏菌2308株wbka、pmm基因缺失株的构建及免疫效果的初步研究

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1、分类号：密级：学号：2010108052单位代码：10759石河子大学硕士学位论文牛种布鲁氏菌2308株wbkA、pmm基因缺失株的构建及免疫效果的初步研究学位申请人桂丹陈创夫教授指导教师乔军教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称预防兽医学研究方向畜禽病原分子生物学所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2013年6月ConstructionandpreliminarystudyofimmuneeffectsofB.abortus2308△wbkAand△pmmstrainsADissertationSubmittedtoShiheziUniv

2、ersityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByGuiDan(PreventiveVeterinaryMedicine)DissertationSupervisor:Prof.ChenChuangfuJune2013课题来源973计划项目项目名称：布鲁氏菌侵染与胞内寄生的分子机制研究项目编号：2010CB530203国家自然科学基金项目项目名称：布鲁氏菌侵染与胞内寄生的分子机制研究项目编号：31001046摘要布鲁氏菌病（Brucellos

3、is，简称布病）是由革兰氏阴性菌布鲁氏菌引起的一类人兽共患的慢性传染病，目前在我国以及世界上大多数国家有比较广泛的流行。该病原菌可感染多种家畜及人，还可感染野生动物，近来还发现该病菌还可感染海洋动物。人类感染布鲁氏菌用抗生素治疗需要持续几个月但不是完全有效，对人类而言没有有效的疫苗，有几个许可的活疫苗可以在牲畜上使用，而这些动物疫苗的效果取决于宿主的种类、免疫剂量、免疫途径。目前世界各国对布病的防控都主要采用的是疫苗接种，然而又因现用疫苗都普遍存在毒力较强，可引起怀孕母畜的流产，甚至还可感染人等缺陷，同时使用了疫苗后难以区分自然感染和疫苗免疫，从

4、而限制了疫苗的实际应用。因此，本研究拟通过缺失牛种布鲁氏菌2308的wbkA，pmm基因构建相应的缺失株，初步评价其毒力和免疫保护效果。同时表达了WBKA，PMM两个蛋白，开发出一种能有效区分自然感染和疫苗免疫的布鲁氏菌弱毒基因缺失株，旨在筛选具有潜在应用价值的疫苗候选株。本文所做的主要工作及成果如下：1.布鲁氏菌2308株wbkA和pmm基因缺失株的构建及鉴定：以牛种布鲁氏菌2308为模板高保真扩增wbkA和pmm基因上下游同源臂，以枯草芽孢杆菌为模板高保真扩增SacB基因，将得到的上下臂SacB与分别连接到pGEM-7zf+，构建pGEM-7

5、zf-∆wbkA-SacB（pwS）和pGEM-7zf-∆pmm-SacB（ppS）。自杀载体pGEM-7Zf+上，分别构建成pGEM-7Zf+-ΔwbkA和pGEM-7zf+-Δpmm，制备牛种布鲁氏菌2308感受态，电转化重组质粒pwS和ppS，通过氨苄、蔗糖的两次筛选得获得ΔwbkA和Δpmm基因缺失株，进行遗传稳定性检测。2.ΔwbkA和Δpmm基因缺失株的毒力及免疫效果的初步评价：在小鼠巨噬细胞RAW264.7水平初步验证ΔwbkA和Δpmm的毒力；用缺失株免疫6周龄昆明白小鼠，通过CFU计数初步评价缺失株的毒力；通过常规血清学试验初步

6、验证小鼠体内的抗体水平，采用间接ELISA方法检测小鼠体内总IgG水平以及细胞因子IFN-γ的水平；对用缺失株免疫30d后的小鼠进行攻毒试验评价其保护效果。3.构建原核表达载体pET-wbkA和pET-pmm及鉴别诊断：用PCR方法分别扩增wbkA和pmm基因，将测序正确的基因序列分别克隆到大肠杆菌表达载体pET-32a上，然后转化至大肠杆菌DE3（BL21）中诱导表达并纯化WBKA和PMM蛋白，再以纯化的WBKA和PMM蛋白作为抗原，与缺失株ΔwbkA和Δpmm免疫的小鼠血清进行Westernblot分析，鉴定血清中是否存在抗WBKA和PMM的

7、抗体。本研究结果表明ΔwbkA和Δpmm缺失株具有一定的遗传稳定性，ΔwbkA和Δpmm缺失株的毒力较亲本株2308相比有一定程度的下降，且毒力与疫苗株S19差异不大。免疫原性试验结果显示同时ΔwbkA和Δpmm缺失株均能诱导机体产生一定的抗体。攻毒试验结果表明缺失株能保护小鼠免受2308强毒株的感染，保护力与疫苗株S19相比略低。WB结果显示ΔwbkA缺失株和Δpmm缺失株免疫的小鼠的血清中不能产生抗WBKA蛋白和PMM蛋白的抗体。关键词：布鲁氏菌；wbkA基因；pmm基因；同源重组；免疫保护性；鉴别诊断AbstractBrucellosisi

8、sazoonoticdiseasecausedbyBrucellawhichisgram-negativeandintracellula