牛种布鲁氏菌强弱毒株差异表达蛋白的功能研究

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1、分类号：密级：学号：2010108026单位代码：10759石河子大学硕士学位论文牛种布鲁氏菌强弱毒株差异表达蛋白的功能研究学位申请人王震陈创夫教授指导教师张辉副教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称基础兽医学研究方向动物疾病病理学所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2013年6月FunctionAnalysisofdifferentialexpressionproteinsbetweenattenuatedstrainandvirulentstrainofBrucellaabortusADissertation

2、SubmittedtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByWagnZhen(PreclinicalVeterinary)DissertationSupervisor:Prof.ChenChuangfuJune,2013石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容

3、外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名：时间：年月日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日课题来源国家973项目

4、项目名称：布鲁氏菌功能基因和蛋白研究项目编号：2010CB530202国家自然科学基金项目项目名称：布鲁氏菌侵染胚胎滋养层细胞过程中关键分子的功能研究项目编号：31001046中文摘要布鲁氏菌病(Brucellosis)是由布鲁氏菌引起的一种细菌性人畜共患的慢性传染病，严重影响了畜牧业健康可持续发展；人类也可通过接触受感染动物的分泌物，或进食受污染的畜产品而受感染，严重威胁人类健康和社会公共卫生安全。布鲁氏菌作为布鲁氏菌病的病原菌，对胚胎滋养层细胞具有一定的亲嗜性，易引起流产，但是其分子致病机制目前还不清楚。布鲁氏菌强

5、弱毒株在自身生长繁殖以及对宿主细胞的侵染、胞内生存等方面存在一定差异，因此，以布鲁氏菌强弱毒株的差异蛋白和胚胎滋养层细胞为研究对象对于布鲁氏菌致病机制的研究具有重要意义。目的：本研究以牛种布鲁氏菌2308强毒株和RB51疫苗株的差异蛋白（DsbG、CcrB、RirA、VceA）为研究对象，构建相应的基因突变株，比较相应的基因突变株和亲本株在自身生长状况，以及侵染滋养层细胞后，对宿主细胞的黏附、胞内生存及凋亡等方面产生的影响，初步探索这些差异蛋白的功能。为揭示布鲁氏菌分子致病机制和布鲁氏菌新型药物的开发奠定基础。方法：（

6、1）以热灭活的牛种布鲁氏菌2308基因组和带有卡那抗性基因的pUC19K质粒为模板，分别对dsbG、ccrB、rirA、vceA基因的上下游同源臂和卡那抗性（Kan）基因进行高保真扩增；通过融合PCR技术将待缺失基因的上下游同源臂与卡那抗性基因融合，将融合片段直接连接到pMD19-T克隆载体上；采用电转化法将同源重组载体转入布鲁氏菌2308感受态细胞中，对S2308ΔdsbG、ΔccrB、ΔrirA和ΔvceA基因突变株进行筛选和遗传稳定性检测；绘制布鲁氏菌生长曲线并观察静置培养后细菌的聚集现象。（2）布鲁氏菌亲本株及

7、S2308ΔdsbG、ΔccrB、ΔrirA和ΔvceA基因突变株侵染胚胎滋养层细胞，对侵染后的细胞进行形态学观察，并对其粘附侵袭力和胞内复制力进行评价，分析布鲁氏菌突变株胞内生存的能力；（3）通过Hoechst荧光染色和DNAladder分析凋亡细胞的细胞核变化及其DNA的片段化，同时通过流式细胞仪对细胞凋亡率进行检测。结果：（1）构建并筛选出布鲁氏菌S2308ΔdsbG、ΔccrB、ΔrirA和ΔvceA基因突变株，且连续10代内未发生回复突变现象。相应的基因突变株体外培养的生长趋势与亲本株2308类似，培养32h

8、细菌进入对数生长期，40h左右进入平台期，但不同时间点细菌的浓度存在差异，布鲁氏菌ΔrirA和ΔvceA基因突变株较亲本株提前4h进入平台期；静置培养的布鲁氏菌基因突变株均呈浑浊生长状态，与亲本株2308相比未发生明显改变；（2）布鲁氏菌S2308ΔdsbG、ΔccrB、ΔrirA和ΔvceA突变株侵染胚胎滋养层细胞（HPT-8）