猪链球菌2型强毒株重要功能蛋白的克隆表达、功能鉴定及其免疫特性研究

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1、学位论文独创性声明本人郑重声明：l、坚持以搿求实、创新"的科学精神从事研究工作。2、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果。3、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。4、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。5、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了谢意。作者签名．遮垒日学位论文使用授权本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制

2、并允许论文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。作者躲如夏作者签名：查兰：坠El期：巡翌=￡：蛰猪链球菌2型强毒株重要功能蛋白的克隆表达、功能鉴定及其免疫特性的研究猪链球菌2型强毒株重要功能蛋白的克隆表达、功能鉴定及其免疫特性的研究捅要猪链球菌(Streptococcussuis，＆suis)是一种重要的人畜共患病病原体，猪链球菌感染不仅可导致猪脑膜炎、心内膜炎、关节炎、肺炎、败血症和猝死症，并可导致从业人员感染出现中毒性休综合症、脑膜炎及败血

3、症等严重疾患。国内外的研究主要集中于&suis2的毒力相关因子，但也仅涉及一些功能性鉴定，新的毒力因子不断被发现并有待进一步探讨。本课题开展了猪链球菌2型(＆suis2)05ZYH33烯醇化酶(EnolaSe)、Suilysin和Hemolysin的研究。1猪链球菌2型Enolase对新近测定的&suis205ZYH33全基因序列进行生物信息学分析，设计合成引物，原核克隆表达并纯化出具有酶活性的&suis205ZYH33Enolase。酶联免疫吸附实验和流式细胞术发现Enolase可部分存在&suis205ZYH33的表面。黏附竞争实验证实

4、&suis2表面Enolase参与对宿主细胞的黏附。溶血空斑实验提示Enolase可能抑制免疫反应。PCR检测er／o在&suis各血清型中普遍存在。Westemblot表明Enolase具有较高的反应原性，由此基于Enolase建立了&suis2ELISA抗体检测方法。Enolase作为一个潜在的毒力因子为进一步探索&suis2的致病机理提供了思路。2猪链球菌2型Suilysin利用PCR技术从&suis205ZYH33基因组DNA中扩增suilysin序列，构建pET32a：：suilysin原核表达质粒，转化入EcoliBL21(DE

5、3)，重组菌在37℃诱导4h时表达产物最多。以包涵体形式存在的重组蛋白经尿素溶解、His．Tag亲和层析纯化和谷胱甘肽复性后，溶血实验表明其具有溶血活性，且活性受温度、二硫苏糖醇(DTT)、p．巯基乙醇、过氧化氢、蛋白酶K等一些理化因素的影响。免疫保护实验显示出Suilysin对Balb／e小鼠有一定的保护作用，有可能作为&suis2疫苗的侯选分子。3猪链球菌2型Hemolysin本实验在对&suis205ZYH33进行全基因组序列测定、ORF预测和功能注释的基础上，对05ZYH33中的05SSUl668编码基因进行系统预测和分析，发现其具

6、有信号肽和跨膜区，主要由DUF21、CBS和CorC．HlyC三部分组成。同源性分析表明与很多菌中具有溶血活性的蛋白具有较高的相似性。由此构建了pET30a：：hemolysin原核表达质粒，为深入探讨Hemolysin的溶血活性及其在&suis2致病中的作用奠定基础。关键字：猪链球菌2型，烯醇化酶，溶血素猪链球菌2型强毒株重要功能蛋白的克隆表达、功能鉴定及其免疫特性的研究Prokearyoticallycloning，expression，characterizationandlmmunologicpropertiesstudyotimp

7、ortantproteinstrom●一‘●^●■^s．suis2highlyvirulentstrainABSTRACTStreptococcussuisisallimportantzoonotiepathogenwhichhasbeenassociatedwithawidevarietyofinfectionsinswine，suchasmeningitis，septicemia,arthritisandpneumonia．TIliSorganismhasalsobeenisolatedfromhumanswithmeningitiso

8、rendocarditisandToxicShockSyndrome．Severalputativevirulencefactorsof&suis2havebeendescrib