SARS病原体鉴定和SARSCoVM蛋白表达及其免疫学功能的研究

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1、中山太学博士掌位论文SARS病骧体鉴定程&l麓釉∞扩鹾蛋鑫表达及冀兔疫学功能的研究IdentificationofSARSp8强壮ge拄，ExpressionandPurificationofSARS-CoVFulI-LengthMproteinandInvestigationonItsImmunologicalCharacteristics专曼名称答辩申请人导师荜僮答辩娄员会主席答辩委员会蚕员擞生耪擎墨辉钧郭辉玉教授泼丽芳教授基础医学豌徽生耪学教硬室2005年8胃30霜广鲻∥州叫。弋筇应夕杼囊v勃沪№善∥≯；，。。荔掰《伊rj事—妒；或漱口滚，稍Vero、VeroE6、MDCK、He

2、la、Hep．2等传代细胞、人胚肺：=倍体细胞(HEL)和人胚肺(}瓣)等细胞系统分离培莽病原体，用超薄切片电镜技术、间接免疫荧光试验、中和试验、RT-PCR和序列测定等方法鉴定所分离到的痰毒。结栗尾Vero、VemE6、MDCK襄HP缨臆铁拣本中分离到一撩瘼毒。阕接免疫荧光试验发观，SARS恢复期病人血清可与瘸毒起反应，在胞膜和胞浆中窭瑷器缳惫茨走；中帮试验维果表明，SARS滚复期病天蠹瀵麓中帮瘸毒对维貔的致细胞病变作用；电镜下可观察刹冠状瘸毒样颗粒：RT-PCR法可扩增到冠状瘸毒特异髓耱因片毅，显其核营酸净列与鬻内外发表的SARS冠状瘸毒楣碰豹基因_

3、葶列相符，同源性达到100％。

4、从而证实从传染憷非典型肺炎病人的漱口液中分离到SARS危状瘸毒，这种病毒与传染性非典型肺炎密誊g相关。冠状瘸毒属基阂组中大约会霄30000个核营酸，是爨翦已知最大斡RNA瘗毒，有包膜，为单正链RNA病毒，在宿主绷胞的胞浆中复制。SARS冠状病毒(SARS-CoV)全蒸瓣缓鸯29751令碱墓缝戚，从5’∞、蝼骞5令主溪开放读强摇foRF)，分别编码RNA聚合酶蛋白(复制酶la，lb)、刺突蛋白(SpikeProtein，s蘩鑫)、氛貘E(EnvelopeProtein，E蛋岛)、貘蛋自(MembraneProtein，M蛋白)和核衣壳缮白(NucleocapsidProtein，N蛋白)

5、，其顺序和大小均与其他冠状病毒襁似。其中，碱基序列263粥^27063nt被摊溺编确病毒221aa的包膜(M)糖蛋岛，BLAST和FASTA分概显示M蛋自慰剐路C臼y的主要包膜基质糖爨自。它与s蛋白相连，娥形成病毒包膜的基本步骤，同时也加速了病毒的装配，作为连接孩表竞鞠瘫毒像膜瓣援粱，与嚣蛋白与衣壳之阕斡辎驻馋用弓l起经感染缨胞膜结构出芽的过程：M蛋白不仪在病毒包膜中火爨存在，而且柱被感染的细照簇主遣大爨存在，M蛋逸憨诱导撬诲藏羰{}俸介等豹病毒孛囊襻耀。鸯报道M焱白中存在B细胞和T细胞表位，所以M蛋白可能介导了删五．舅C白矿的特异侮液免疫帮缫胞免疫应答，可作为SARS疫荣磷究豹候选抗

6、原。本磷究成功她用大肠杼藏BL21(DE3)表达了SARS-CoVM蛋皇联，表达出戆融合M蛋白质Mr约为52000，正好是Mr均为26000的SARS-CoVM蛋白质和GST爨鑫痰豹融合。在实验审发现遴过终羝诱导表这澄度(28℃)骧及增麴遴气量，可以使诱导的M灏白不以包涵体的形式存在，并且可以分泌表达，同时获得较离的表达豢(34．8％)。本戮究获褥了SARs灏获瘸番Gs摹M融合蛋蠢，用Westernblot和ELISA分析发现它可与SARS患者的恢复期血清产生特异性的结合反应。Iit本研究将RT-PCR扩增出的M基因克隆到巴氏毕赤酵母表达载体pPICZ。嚣，邈穿魏法将重缀俸整会入酵母藏

7、PtpastorisX-33，经撼生素Zeocin箩雾逸产生的转化子进行表型撩定，取Mut+菌用甲醇诱导表达，SDS-PAGE检测其液达产物。Mut+黪母转纯蓥经擎簿诱导霹分泌表达终65kDa黧42kDa熬蛋窭溪，与SARS恢复期病人衄清的免疫印迹和ELISA证实它们为特异的重缀M蛋囱。本磷究同时弼上述表选静SARS-CoVM蛋自分剐免疫Balb／c小鼠，发现两种M骚白均能刺激小鼠相应的体液免疫应答和细胞免疫应答；即均具有免疫原性，可以作为驻单位痰苗的候选；但遮两种蛋白抗原畿存在差异。总之，本实验就是在运用电镱法和RT-PCR等技术检测SAPS患者癃原的基础上，成功地分离出SARS-C

8、oV。并诞实RT-PCR可用予临床检测SARS-CoV,Vero-E6缀熬檬是分离培耱SARS-Co滋努憨缨黪模型。然嚣，耀RT-PCR接术扩增赛SARS-CoVM基因，通过大肠杆菌的表达系统和巴斯德毕券酵母袭达系统成功地表达了副裕国yM蛋鑫；著发溪它稻均蠢鞍特雾豹兔疫获瘦经；溺露溺液这瓣M骚白免痰Balb／Cd、鼠，研究M爨自的免痰原性；这些为进一步研制SARS-CoV篮单位疫蔺和建立快速诊断方法耔下了基础。【关键词】SARS；SARS冠状病