猪带绦虫热休克蛋白90α基因的克隆表达及免疫学功能的初步研究

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1、《中国图书资料分类法》分类号：R383单位代码：10660学号：S090030贵阳医学院2012届硕士学位论文猪带绦虫热休克蛋白90α基因的克隆表达及免疫学功能的初步研究研究生：陈小睿导师：黄江教授年级：2009级专业：病原生物学2012年5月26日目录摘要···························1前言···························3材料与方法·······················5结果···························16讨论······················

2、·····23参考文献·························26英文摘要·························28主要英文缩写词···················30致谢···························31学位论文独创性声明···············32附录1,2·······················33综述···························35贵阳医学院2012届硕士学位论文猪带绦虫热休克蛋白90α基因的克隆表达及免疫学功能的初步研究专业：病原生物学硕士

3、研究生：陈小睿导师：黄江教授摘要：目的生物信息学分析和预测猪带绦虫热休克蛋白90α(TaeniasolniumHeatshockprotein90alpha）基因及其编码蛋白的结构和特性，原核克隆表达猪带绦虫热休克蛋白90α基因(TsHSP90α),对重组TsHSP90α其免疫学功能进行初步研究。方法利用美国国家生物技术信息中心(NCBI,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（ExPASY,http://ca.expasy.org/）中有关基因和蛋白的序列和结构信息分析的各种

4、工具，结合其它生物信息学分析软件包，如VectorNTIsuite,从猪带绦虫全长cDNA质粒文库中识别TsHSP90α基因及其编码区，分析、预测该基因编码蛋白质的理化特性、翻译后的修饰位点、功能域、亚细胞定位、拓扑结构、二级结构、三维空间构象等。将猪带绦虫成虫HSP90α克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中,在大肠埃希菌BL21/DE3中用IPTG诱导表达,表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化,纯化的重组蛋白用蛋白印迹(WesternBlotting)进行

5、免疫学分析。结果该基因全长1079bp,编码区为176bp－1054bp，编码292个氨基酸，为全长基因；BLASTX发现该基因是热休克蛋白90α的同源基因；PCR、双酶切及DNA测序结果均表明pET-28a(+)-TsHSP90α重组质粒构建成功。SDS-PAGE结果表明目的基因在大肠埃希菌BL21/DE3中获得高效表达,经亲和层析获得了高纯度蛋白。重组蛋白可被其免疫的SD大鼠血清识别,表明其具有免疫原性；同时，重组蛋白能被猪带绦虫患者，亚洲带绦虫患者及牛带绦虫患者血清识别，表明重组蛋白具有免疫反应性。结论应用生物信息方法从猪带绦虫成

6、虫cDNA文库中筛选出了HSP90α基因，并对其所编码蛋白的结构与功能进行预测。猪带绦虫成虫热休克蛋白90α基因可在大肠埃希菌BL21/DE3中获得具有免疫活性的高效表达。western-blotting显示重组蛋白具有免疫原性和免疫反应性。通过本研究1贵阳医学院2012届硕士学位论文为进一步阐明该蛋白在猪带绦虫生理代谢的作用机制奠定了基础。同时对该蛋白免疫学功能的初步研究也为今后开展带绦虫病的应用型研究提供一定线索。关键词：猪带绦虫；热休克蛋白90α；结构与功能；生物信息学；基因克隆;原核表达；免疫功能学初步分析2贵阳医学院2012届

7、硕士学位论文前言猪带绦虫（TaeniasoliumLinnaeus,1758）、牛带绦虫（TaeniasaginaiaGoeze,1782）是寄生人体的主要带绦虫，近三十年来，在东南亚和西太平洋的许[1-4]多国家和地区发现的亚洲带绦虫（Taeniaasiatica）。其中猪带绦虫幼虫又[5-8]会引起严重的囊虫病。据2001－2004年我国人体重要寄生虫病现状的调查结果显示，带绦虫感染率比1990年上升了52.47％，感染带绦虫人数约为55万人；人囊虫病的感染率也呈上升趋势，感染人数约为110万，并且主要分布在西部贫[9]困地区。这从

8、一个侧面提示我们，流行区人群的饮食习惯并没有完全改变、人[8]们的预防意识仍然不强。人是猪带绦虫唯一的终宿主，成虫寄生于人的肠道，可引起消化不良、腹痛、腹泻等消化道症状，猪带绦虫成虫患者同时还是人囊虫病和猪