牛布鲁氏菌抗原蛋白的克隆表达及其刺激能力的评价

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1、分‘Ｗ己石、雄．＾資朵知劈１＾Ｓ：？：巧？马—．三？線載冷托￣备罢記签三＾心心式兮？，？＇譯每＾ＹＡＮＧＺＨ。鬧画ｎＹ巧争．－ＵＭ＇－—‘片八？－－＇＇＊－？？，公＇：＾八４Ｖ．：击学化；懸議＾德通！ｉ（学术型巧．為或據．’．讀霧呀．方巧Ｖ琴京鍵参：項如萨＇參許击鲁氏菌抗原蛋＞白尚克隆表达ｉ其刺激藻力的评１巧秦等＇．＜－－朽？Ｃ：共＾？，‘今．杉乂．：＾４－．指导教师姓名：焦新安教授，，江苏扬州２２５００９扬州大学，香．Ｖ；六陈祥副教授，

2、扬州大学，江苏扬州，２２５００９．．申请学位级别：硕壬学科专业名称：遗传学论文提交日期０１５５２０１５：為：２年月论文答辩日期；年５巧学位授予单位１５年６月：扬州大学学位授予日期：２０＾、＾／答辩委员会主席：、．．－：；＞戶．交＿違．：＾—齡矜＇冰术難譯論鱗禱藝杜强１＝牛布鲁氏菌抗原蛋白的克隆表达及其刺激能力的评价牛布鲁巧菌抗原蛋白的克隆表达及其刺激能力的评价研究生：杜强导师：焦新安教授陈祥副教授摘要一布鲁氏菌病（Ｂｒｕｃｅ化ｓｉｓ，

3、简称布病）是由布鲁氏菌（公ｎ／ｃｅ仏？）引起的种人兽共患传染病，，且。感染布病之后会累及多个器官的功能衰退表现为流产和不孕不育等症状病程较长，难Ｌ义冶愈，严重者丧失劳动和生活能为，在给社会造。布病在世界各地的广泛流行成重大经济损失的同时也严重威胁着社会的健康安全，及时准确地诊断布病是防控布病的一Ｐ，レ关键因素之。常规的布病诊断方法利用ＬＳ作为检测抗原但由于布病疫苗的使用ッ及ＬＰＳ与耶尔森菌等之间存在抗原结构相似性，布病的诊断容易出现假阳性和交叉反应，所Ｗ只有先进的实验室诊断方法才能

4、准确诊断布病。－Ｌ７－本研究通过大肠杆菌原核表达系统成功表达了ｒＨｉｓ／ＬＩ２（基因名Ｗ化）、ｒＨｉｓＢｐ２６、－－Ｈ－－ｒｉｓＧｒｏＥＬ、ＷｉｓＣｕＺｎＳＯＤ（基因名５〇＾＾／）、『比５巧９和出知〇１１１口２５等６种布鲁氏菌抗－ＰＰＤ原蛋白，并使用其中的５种Ｗ可溶形式表达的重组蛋白及布鲁氏菌素ＣＢｒ）进行牛布－－ＩＦＮ，ＩＦＮ病外周血Ｙ体外释放试验期望筛选出具有良好刺激效果的持异性Ｙ刺激原，为一进步研究奠定基础。１、布鲁氏菌６种抗原蛋白的重组表达、纯化和鉴定＞化、巧ｕ￡Ｚ

5、、６苗５根据目的基因序列设计引物，通过ＰＣ民扩增的方法获得巧／？２（５、〇所、／批９和５（？／／目的片段，大小分别为巧５ｂｐ、１６４１ｂｐ、７５３ｂｐ、６４２ｂｐ、１２０６ｂｐ和５２２咕，将目的片段连接到载体并进行测序确认。将测序正确的目的片段转入表达载体，最终构建＇■－－－－－＋ａ￡Ｘ６５Ｉ－９了ｐＥＴ２８ａｗ化、Ｃｏｌｃ＾，、ｏＩｃ＾６、ＣｏｌｄＩｏ、Ｃｏｌｄ和ｐＣｏｌｄＫｓ０＾／７（）ｐ各ｐＣ批ｐ呼Ｚｐパ原核表达质粒，分别将６种重组质粒转化至大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３。经ＩＰ

6、ＴＧ诱导表达Ｗ及）－犯ＳＰＡＧＥ结果分析，分别出现预期的目的条带，大小分别为２０ｋＤａ、６５ｋＤａ、３３ｋＤａ、－－２８ｋＤａ、４７ｋＤａ和２４ｋＤａ，说明重组蛋白获得表达，其中ｒＨｉｓＬ７化１２、出ｉｓＧｒｏＥＬ、－－－Ｂｒｓ－ｒＨｓＣｕＺｎ－２６，ｓ２５ｒＨｉｓｐ、ＨｉＰ３９和ｉＳＯＤＷ胞内可溶形式表达抽ｉＯｍｐ为包涵体形式表达，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ结果显示６。通过巧Ｓ免疫亲和层析法进行蛋白的纯化种重组蛋白均能与Ｈｉｓ单抗发生特异性反应，表明６种重组蛋白获得成功表达。

7、２扬州大学硕±学位论文２、牛布鲁氏苗抗原蛋白的剌教能力评价－５白Ｗ及ＢｒＰＰＤ进行牛布病外周血－使用本实验表达纯化的种重组蛋ＩＦＮＹ体外释放试－验的检测。在临床样品的刺激实验中，ＷＬ７／Ｌ１２为則激原的圧ＮＹ释放试验与ＥＬＩＳＡ检测＇ｉ＞０－＞０（Ｐｅａｒｓｏｎｓｒ６ＢＰＰＤ（Ｐ．２结果之间表现出最高的正相关性．），其次为ｒｅａｒｓｏｎｓｒ）一一具有５レ义及Ｂｒ－ＰＰＤ进行的样品检定相关性，也表现出定的刺激潜力；在种重组蛋白－－／ｒＰＰＤ为ＩＦＮ体外释放试验与ＥＬＩＳＡ检

8、测结果之间具有较测中，ＷＬ７Ｌ１２和Ｂ刺激原的Ｙ高的符合率（总符合率均为８９．０％），Ｌ７／Ｌ１２的敏感性、特异性、阳性符合率和阴性符合ｒ－ＰＰＤ５０．０％％．７％，７５．０％和９０．７％，表现出作为刺激原的潜能。Ｂ、率分别为，的敏感性特异性、阳性符合率和阴性符合率分别５４．８％，９４．１％，７０．８％和８８．９％，显示出良好的刺激能力。而其他４种重组蛋白则没有显示出较好的符合率。综上所述，在５种候选抗原和